Materiaalit
4′-Hydroksiatsobentseeni-2-karboksyylihapon (HABA), biotiini, N-(2-aminoetyyli)maleimiditrifluoroasetaattisuola (aminomaleimidi), etikkahappo, natriumasetaatti, fosforihappo, magnesiumkloridi, Tween 20, Tween 80, naudan seerumin albumiini (BSA), dimetyylisulfoksidi (DMSO), dekstraani (Dex; MW 15-25 kg mol-1-Mn 16 kg/mol; lyofilisoitu ennen käyttöä), 4-nitrofenyylikloroformiaatti (PNC; sublimoitu ennen käyttöä), LiCl (kuivattu 110 °C:ssa ennen käyttöä), tyramiini (TA), vedetön pyridiini, vedetön N,N-dimetyyliformamidi (DMF), N,N-diisopropyylietyyliamiini (DIPEA), piperidiini, aminohapot, etikkahappoanhydridi, triisopropyylisilaani, trifluorietikkahappo (TFA), natriumhydroksidi (NaOH), N-Boc-1,4-butaanidiamiini (NH2-Boc), natriumbikarbonaatti (NaHCO3), biotiiniatto565, biotiini-4-fluoresceiini (biotiini-FITC), 6-aminofluoresceiini, piparjuuriperoksidaasi (HRP, tyyppi VI), biotiini-HRP, vetyperoksidi (H2O2; inhibiittorin kanssa), naudan sikiöseerumi (FBS), kalseiini AM, etidiumhomodimeeri-1 (EthD-1), tiatsolyylisininen tetratsoliumsininen (MTT) ja kaikki muut liuottimet, ellei toisin mainita, on ostettu Sigma-Aldrichilta. Luunmuotoinen master ostettiin LEGO:lta. Polydimetyylisiloksaani (PDMS; Sylgard 184) ostettiin Dow Corningilta. Fosfaattipuskuroitu suolaliuos (PBS) ostettiin Lonzalta. Rekombinantti ihmisen BMP7 (354-BP-010), 3,3′,5,5′-tetrametyylibentsidiini (TMB) ja H2SO4 ostettiin R&D Systemsiltä. Fmoc-Rink 4-metyylibentshydrylamiinihartsi (MBHA) (50 mg:n asteikko, substituutio 0,52 mmol g-1) ja N,N,N,N′,N′,N′-tetrametyyli-O-(1H-bentsotriatsoli-1-yyli)uroniumheksafluorofosfaatti (HBTU) ostettiin MultiSynTechiltä. Kloroformi ja 1-metyyli-2-pyrrolidinoni (NMP) ostettiin WR Chemicalsilta. VHH-vasta-aine BMP7:ää vastaan (Q32c-lab, klooni G7) ja polyklonaalinen kanin vasta-aine VHH:ta vastaan (K1216) ostettiin QVQ:lta. Biotinyloitu IL-1β-vasta-aine (508301, klooni JK1B2, RRID:AB_315512) ostettiin Biolegendiltä. Biotinyloitu IgG (Biotin-SP AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG; 711-065-152) ostettiin Jackson Immunoresearchilta. HRP-konjugoitu toissijainen vuohen vasta-aine kania vastaan (P0448) ostettiin Dakolta. Biotinyloituja kulta-nanohiukkasia (20 nm) ostettiin Cytodiagnosticsilta. Biotinyloitu peptidi, jonka aminohapposekvenssi on KGLPLGNSH, ostettiin Pepscanilta. Succinimidyl 6-(biotinamido)hexanoate (biotin-LC-NHS) ostettiin ApexBiolta. Neutravidiini, N-hydroksisukkinimidi-destiobiotiini (EZ-Link NHS-destiobiotiini), 4′,6-diamidino-2-fenylindoli (DAPI) ja 3,3′-diaminobensidiini (DAB) -värjäyssetti ostettiin ThermoFisher Scientificiltä. Esiaktivoidut anturit amiinikytkentää varten (G-tyypin easy2spot) ostettiin Ssens BV:ltä. Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), penisilliini ja streptomysiini sekä trypsiini-EDTA ostettiin Gibcolta. Reporter Lysis Buffer (E397A), luciferaasimääritysreagenssi (E1483) ja QuantiFluor dsDNA System ostettiin Promegalta. C2C12-BRE-Luc-solut toimitti ystävällisesti prof. Daniel B. Rifkin.
Neutravidiinin monivalenssianalyysi
Neutravidiinin biotiinia sitovien taskujen lukumäärän analysointiin käytettiin HABA:n spektrofotometristä analyysiä. Erityisesti HABA voi spesifisesti sitoutua (neutr)avidiiniin samalla tavalla kuin biotiini, mutta alhaisemmalla sitoutumisaffiniteetilla. HABA/neutravidiinikompleksilla on absorptiohuippu 500 nm:n tienoilla. Sitoutumattoman HABA:n absorptiohuippu on noin 350 nm. HABA:n syrjäytymistä biotiinilla voidaan siis arvioida mittaamalla absorbanssi 350 ja 500 nm:ssä. Neutravidiinin biotiinia sitovien taskujen lukumäärän määrittämiseksi sitä inkuboitiin ensin ylimääräisen HABA:n kanssa niin, että muodostui täysin tyydyttyneitä HABA/neutravidiinikomplekseja. Biotiinia lisättiin näihin komplekseihin neutravidiinin ja biotiinin moolisuhteessa 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5 ja 1:6. Kunkin neutravidiini/biotiinisuhteen osalta sekä HABA/neutravidiinikompleksin että vapaan HABA:n määrä määritettiin mittaamalla absorbanssi 500 nm:ssä ja 350 nm:ssä ND1000-spektrofotometrillä (ThermoFisher scientific). Taso 3,2 biotiini/neutravidiini osoitti biotiinia sitovien taskujen lukumäärän, joka oli valmistajan spesifikaatiolomakkeen mukainen (3,1 biotiini/neutravidiini).
SPRi-mittaukset
Biotinyloitu IL-1B immobilisoitiin G-tyypin easy2spot-antureihin jatkuvan virtauksen spotterilla (Wasatch Microfluidics). Geelityyppisiä antureita käytettiin niiden suuremman sitoutumiskapasiteetin ja evanesenssikentän tehokkaamman hyödyntämisen vuoksi verrattuna tasopintaiseen pinta-anturiin. Immobilisointireaktio suoritettiin 50 mM etikkahappopuskurissa (150 µl pistettä kohti) vasta-ainepitoisuuksilla 5, 2,5, 1,25 ja 0,625 µg ml-1. Kontrollina käytettiin BSA:ta, jonka pitoisuus oli 5 µg/ml. Immobilisointipuskurilla (pH 4,6) saatiin aikaan vasta-ainekytkentä, jossa aktiivisuus säilyi parhaiten, ja siksi sitä käytettiin kaikissa kokeissa. Epäspesifisten vuorovaikutusten vähentämiseksi anturi deaktivoitiin 1 %:lla (w/v) BSA:ta 50 mM asetaattipuskurissa (pH 4,6) 7 minuutin ajan ja sen jälkeen 0,2 M etanoliamiinilla (pH 8,5) vielä 7 minuutin ajan. SPRi suoritettiin MX96-järjestelmällä, jossa oli SUIT-toimintaohjelmisto (IBIS). Neutravidiini, D-@BMP7, B-@BMP7 ja BMP7 liuotettiin systeemipuskuriin, joka koostui PBS:stä, jossa oli 0,5 % (w/v) BSA:ta ja 0,075 % (v/v) Tween80:tä pitoisuuksina 250, 100, 100 ja 100 nM. Biotiini liuotettiin 400 µM:n pitoisuuteen järjestelmäpuskuriin, jota täydennettiin 0,1 % (v/v) DMSO:lla. Edestakainen virtaus asetettiin 10 µl min-1 virtaussoluun, joka sisälsi 12 µl näytettä. Sprint-ohjelmistoa käytettiin tiedonkeruuseen ja referointiin yhteensä kuudesta spotista olosuhdetta kohti. Tiedot vietiin sen jälkeen Matlab R2015a -ohjelmaan lisäanalyysiä ja laadunvalvontaa varten käyttäen mukautettuja skriptejä (saatavilla pyynnöstä). Supramolekulaaristen kompleksien dissosiaatiovakiot määritettiin seuraavasti: ensin anturi pestiin kolmella tyhjällä injektiolla (eli järjestelmäpuskurilla) vuorovaikutussignaalien taustan muodostamiseksi. Sitten käytettiin kaskadimenetelmää kompleksin komponenttien välisen affiniteetin määrittämiseksi. Tätä varten anturia inkuboitiin puskurilla, jota seurasi neutravidiini, D-@BMP7 tai B-@BMP7, BMP7 ja lopuksi biotiiniliuos. Kaskadivuorovaikutusten assosiaatioaika oli 30 minuuttia, jota seurasi 15 minuutin dissosiaatio. Kunkin injektion välillä anturi pestiin järjestelmäpuskurilla. Siirtymävuorovaikutuksen assosiaatioaika biotiinin kanssa oli 180 minuuttia, ja se suoritettiin kahdesti. Kinetiikkaa voitiin kuvata yksinkertaisella 1:1 Langmuir-vuorovaikutuksella, joka voidaan kuvata eksponentiaalisella yhtälöllä (3).
Tässä yhtälössä Rmax on ligandin sitoutumiskapasiteetti (RU), kon on assosioitumisnopeus (M-1 s-1), koff on dissosioitumisnopeus (s-1), c on analyytin konsentraatio (M) ja t on aika vuorovaikutuksen alkamisesta (s). Dissosiaatiovakio Kd on määritelty seuraavasti: koff/kon. Affiniteettitietojen analysoimiseen Langmuirin vuorovaikutusta sovittamalla käytettiin Matlab-ohjelmistoa ja mukautettuja skriptejä. Lyhyesti sanottuna aihiot vähennettiin ja signaali nollattiin ensimmäiseen vuorovaikutukseen. Tietyn vuorovaikutuksen affiniteetin määrittämiseksi määritettiin ensin koff-nopeus dissosiaatiovaiheessa. Tämän jälkeen määritettiin kon-nopeus käyttäen kiinteää koffia. Biotiinin kanssa tapahtuvaa siirtymistä varten koff-nopeus määritettiin assosiaatiovaiheessa.
Dex-TAB:n synteesi ja karakterisointi
Dekstraani reagoi p-nitrofenyylikloroformiaatin (PNC) kanssa muodostaen p-nitrofenyylikarbonaattikonjugaatteja, jotka käsiteltiin sen jälkeen primaarisia amiineja sisältävillä yhdisteillä (Täydentävä kuva 2). Dekstraani-p-nitrofenyylikarbonaattikonjugaatit (Dex-PNC) syntetisoitiin seuraavasti. Tyypillisessä kokeessa dekstraani (3,0 g, 56,3 mmol OH-ryhmiä) liuotettiin DMF:ään (200 ml, joka sisälsi 2,4 g LiCl:ää) 90 °C:ssa typpi-ilmakehässä. Kun dekstraani oli liuennut, seos jäähdytettiin 0 °C:een. Pyridiini (1,5 ml, 18,6 mmol) ja sen jälkeen PNC (2,8 g, 13,9 mmol) lisättiin liuokseen pieninä annoksina sekoittaen ja pitäen lämpötila 0 °C:ssa. Reaktion annettiin jatkua tunnin ajan ja tuote saostettiin kylmään etanoliin. Saostuma suodatettiin ja pestiin etanolilla ja sen jälkeen dietyylieetterillä, minkä jälkeen se kuivattiin tyhjiöuunissa. Dekstraani-tyramiini-butyyliamiini (Dex-TA-NH2) syntetisoitiin seuraavasti. Dex-PNC reagoi ensin N-Boc-1,4-diaminobutaanin ja sitten tyramiinin kanssa. Suojaava t-butyylioksikarbonyyliryhmä poistettiin reagoimalla TFA:lla. Tyypillisessä kokeessa Dex-PNC28 (1,0 g, 1,36 mmol PNC-ryhmiä) liuotettiin 16 ml:aan DMF:ää. N-Boc-1,4-diaminobutaani (0,09 g, 0,48 mmol) lisättiin typpivirtauksessa ja reaktion annettiin jatkua 15 minuutin ajan. Tämän jälkeen lisättiin tyramiinia (0,20 g, 1,46 mmol) ja reaktion annettiin jatkua tunnin ajan. Tuote saostettiin kylmässä etanolissa, sakka suodatettiin ja pestiin etanolilla ja dietyylieetterillä ja kuivattiin sitten tyhjiöuunissa. Boc-suojattu Dex-TA-NH (0,85 g, 0,47 mmol) liuotettiin 10 ml:aan deionisoitua vettä. Trifluorietikkahappoa (TFA) (1 ml, 13,06 mmol) lisättiin typpi-ilmakehässä ja sekoitettiin yön yli. Reaktioseos neutraloitiin 2 M NaOH-liuoksella ja puhdistettiin dialyysillä (1000 Da:n molekyylipainon katkaisu) 150 mM NaCl-liuosta vasten 48 tunnin ajan ja deionisoitua vettä vasten 24 tunnin ajan, minkä jälkeen se eristettiin lyofilisoimalla. Dex-TA-NH2 funktionalisoitiin edelleen biotiinilla reagoimalla 2,5 g l-1 Dex-TA-NH2:ta 20-kertaisen molaarisen ylimäärän biotiini-LC-NHS:n kanssa vähintään 1 tunnin ajan 0,1 M bikarbonaattipuskurissa (pH 8,5) (täydentävä kuva 3). Dex-TAB puhdistettiin ja konsentroitiin sen jälkeen spin-suodatinkolonnilla, jossa on 3 kDa:n molekyylipainon cut-off. Dex-PNC:n, Dex-TA-NH2:n ja Dex-TAB:n onnistunut synteesi varmistettiin käyttämällä 1H NMR:ää (AVANCE III HD NanoBay 400 MHz, Bruker) DMSO-d6:ssa tai D2O:ssa. Konjugoituneiden tyramiini- ja butyyliamiiniryhmien lukumäärä 100:aa dekstraanin anhydroglukoosirengasta kohti määritettiin laskemalla dekstraanin (δ 4,0-5,8 ppm) ja tyramiiniryhmien (δ 6,66 ja δ 6,98 ppm) integroitujen signaalien sekä dekstraanin ja butyyliamiiniryhmien integroitujen signaalien (δ 1,4-1,5 ppm) suhteet. Konjugoitujen biotiiniryhmien lukumäärä 100:aa dekstraanin anhydroglukoosirengasta kohti määritettiin laskemalla tyramiiniryhmien (δ 6,66 ppm ja δ 6,98 ppm) ja kytketyn 6-amino-kapronihappovälikappaleen integroitujen signaalien suhde (δ 2.13).
Dex-TAB:n ristisilloittaminen ja ortogonaalinen jälkifunktionalisointi
Dex-TAB-hydrogeelirakenteet valmistettiin sekoittamalla 5 % (w/v) Dex-TAB, 3 U ml-1 piparjuuriperoksidaasia ja 0,05 % (w/v) H2O2. Ortogonaalista jälkifunktionalisointia varten Dex-TAB-hydrogeelejä inkuboitiin peräkkäin 1 µM neutravidiinilla pesupuskurissa, joka koostui 1 % (w/v) BSA:sta PBS:ssä, pestiin pesupuskurilla sitoutumattoman neutravidiinin poistamiseksi, inkuboitiin 1 µM:lla biotinyloidulla tai destiobiotinyloidulla molekyylillä, jota haluttiin testata pesupuskurissa, ja pestiin jälleen pesupuskurilla sitoutumattomien molekyylien poistamiseksi. Dex-TAB/neutravidiini/destiobiotiinikonstruktiot voidaan tämän jälkeen altistaa kiinnostaville biotinyloiduille molekyyleille vastakkaissuuntaisen biokemiallisen gradientin luomiseksi. Fluoresenssimikroskopiaa (EVOS FL), konfokaalista fluoresenssimikroskopiaa (Zeiss LSM 510 ja Nikon A1+) ja fluoresenssin palautumista valohäviämisen jälkeen (FRAP; Zeiss LSM 510) mikrogeelit funktionalisoitiin suoraan streptavidiini-FITC:llä tai edellä kuvatun neutravidiinifunktionalisoinnin jälkeen funktionalisoitiin biotiiniatto565:llä, biotiini-FITC:llä ja/tai destiobiotiini-FITC:llä, joka valmistettiin talossa kytkemällä destiobiotiini-NHS 6-aminofluoreseiiniin 1 M:n bikarbonaattipuskurissa (pH 8). FRAP-käyrät saatiin piirtämällä ajan funktiona valkaisupisteen fluoresenssin intensiteetti miinus tausta, joka on normalisoitu valkaisunopeudella korjatulle keskimääräiselle intensiteetille ennen valkaisua, jossa valkaisunopeus määritettiin normalisoimalla näytteen fluoresenssin intensiteetti valkaisupisteen lisäksi sen keskimääräiselle intensiteetille ennen valkaisua. Destiobiotiini/biotiini-siirtymän karakterisoimiseksi Dex-TAB-hydrogeelikonstruktiot funktionalisoitiin peräkkäin neutravidiinilla, pestiin PBS:llä, funktionalisoitiin destiobiotiini-FITC:llä, pestiin PBS:llä ja funktionalisoitiin biotiiniatto565:llä, samalla kun ne kuvattiin fluoresenssikonfokaalimikroskopialla. Lopuksi hydrogeelit pestiin perusteellisesti useita kertoja PBS:llä sitoutumattoman B-ATTO:n poistamiseksi ja kuvattiin fluoresenssikonfokaalimikroskopialla B-ATTO:lla korvatun D-FITC:n suhteellisen määrän kvantifioimiseksi. Koe toistettiin muilla biotiiniyhdisteillä lähestymistavan yleispätevyyden osoittamiseksi. Neutravidiini/D-FITC-funktionalisoituja Dex-TAB-hydrogeelejä inkuboitiin ja seurattiin jatkuvasti 8 päivän ajan 1 µM biotiinia, biotinyloidun peptidin (B-peptidi; aminohapposekvenssi KGLPLGNSH), HRP:n (B-HRP), immunoglobuliini G:n (B-IgG) tai kultaisten nanohiukkasten (B-GNP) läsnäollessa 1 µM biotiinia, biotinyloidun peptidiä tai kultaisia nanohiukkasia (B-GNP) PBS:ssa. Näytteet pestiin perusteellisesti PBS:llä vähintään yhden päivän ajan sitoutumattomien osien poistamiseksi ennen D-FITC-intensiteetin analysointia. Supramolekulaarisesti kompleksoituneen B-HRP:n biologinen toiminta arvioitiin käyttämällä DAB-värjäyssarjaa valmistajan protokollan mukaisesti. Kolmiulotteiset luunmuotoiset biotinyloidut hydrogeelit luotiin ruiskuvalamalla Dex-TAB:tä polydimetyylisiloksaanimuottiin (PDMS), joka valmistettiin pienoismallin avulla. Hydrogeeliluut funktionalisoitiin FITC:llä homogeenisesti inkuboimalla niitä sen jälkeen yön yli 1 µM neutravidiini-, PBS- ja 1 µM D-FITC-liuosten kanssa. Kun luunmuotoisten hydrogeelien yläosat oli pesty perusteellisesti PBS:llä, ne inkuboitiin 1 µM B-ATTO:lla ajoitetun kastopäällystyksen avulla, minkä jälkeen ne pestiin PBS:llä sitoutumattomien fluorofoorien poistamiseksi ja analysoitiin fluoresenssimikroskopialla. Supramolekulaarisen kompleksoitumisen pitkäaikaiskestävyyden tutkimiseksi kaksi noin 5 × 5 × 5 mm:n kokoista Dex-TAB-hydrogeeliä leimattiin yksinomaan D-FITC:llä ja B-FITC:llä, pestiin perusteellisesti PBS:llä ja sidottiin kovalenttisesti käyttämällä välikappaleena puhdasta (eli leimaamatonta) Dex-TA:ta tyramiinirakenteiden entsymaattisen ristisilloittamisen avulla. Yhdistettyjä hydrogeelirakenteita inkuboitiin sitten PBS:ssä ja kuvattiin jatkuvasti konfokaalisella fluoresenssimikroskopialla 2 viikon ajan destiobiotinyloitujen ja biotinyloitujen mallien vakauden tutkimiseksi. Kaikkien fluoresoivien kuvien poikkileikkausintensiteetit määritettiin ImageJ-ohjelmistolla.
Hydrogeeliverkon analyysi
Diffuusioanalyysi suoritettiin Dex-TAB-hydrogeelirakenteiden jälkifunktionalisoinnin vaikutuksen analysoimiseksi monivalenttisella neutravidiinilla hydrogeeliverkon ominaisuuksiin. Tätä varten koskemattomiin Dex-TAB-hydrogeelikonstruktioihin ja konstruktioihin, jotka oli jälkifunktionalisoitu homogeenisesti käyttämällä ylenmääräistä neutravidiinia, yhdistettiin FITC-merkittyä dekstraania, jonka hydrodynaamiset säteet RH = 2,3 nm (10 kDa), RH = 8,5 nm (150 kDa) ja RH = 27 nm (2000 kDa). Tämän jälkeen fluoresoivissa liuoksissa olevat hydrogeelirakenteet analysoitiin fluoresenssikonfokaalikuvantamisella (Zeiss LSM 510), ja fluoresenssin intensiteetti rakenteen sisällä ja ulkopuolella kvantifioitiin ImageJ-ohjelmistolla. Fluoresenssimerkittyjen dekstraanimolekyylien suhteellinen läpäisy Dex-TAB:hen määritettiin normalisoimalla intensiteetti hydrogeelien ulkopuolella olevaan fluoresenssin intensiteettiin. Samaa lähestymistapaa käytettiin kvantifioimaan ja vertailemaan 5 %:n (w/v) Dex-TAB:n suhteellista läpäisevyyttä FITC-merkityille tavanomaisille IgG-vasta-aineille ja VHH:lle.
VHH:n modifiointi ja karakterisointi
Maleimidikonjugoitu destiobiotiini syntetisoitiin reagoimalla aminomaleimidin ja destiobiotiini-NHS:n kanssa 2 tunnin ajan bikarbonaattipuskurissa (pH 8). Destiobiotiinimaleimidi puhdistettiin korkeapainenestekromatografialla 2545 Quaternary Gradient Module -moduulilla (Waters) 90 %:sta 10 %:iin vettä/asetonitriiliä (0,1 % trifluorietikkahappoa (TFA)) 100 %:iin asetonitriiliä (0,1 % TFA). Kerätty tuote karakterisoitiin massaspektrometrisesti; MS(ESI): m/z = 336,96 (laskettu m/z = 337,18 C16H24N4O4:lle). Liuottimet haihdutettiin pyörivällä tyhjiöhaihduttimella, minkä jälkeen destiobiotiinimaleimidi suspendoitiin uudelleen milliQ-veteen, jäädytettiin nestemäisessä typessä ja lyofilisoitiin yön yli. Destiobiotinyloitu ja biotinyloitu VHH syntetisoitiin QVQ BV:llä reagoimalla VHH:n modifioimaton kysteiini maleimidikonjugoidun destiobiotiinin ja maleimidikonjugoidun biotiinin kanssa. Käytimme ELISA-menetelmää arvioidaksemme modifioimattoman VHH:n affiniteettia BMP7:ää vastaan verrattuna destiobiotinyloituun (D-@BMP7) ja biotinyloituun (B-@BMP7) VHH:hen. Tätä varten 96-kuoppainen Maxisorp-levy päällystettiin yön yli 4 °C:ssa 0,5 µg ml-1 ihmisen BMP7:llä PBS:ssä. Levyt estettiin 4-prosenttisella rasvattomalla maidolla PBS:ssä ja niihin lisättiin eri pitoisuuksia (0-5 µM) VHH:ta 1-prosenttisessa rasvattomassa maidossa. VHH:n toteaminen tehtiin käyttämällä polyklonaalista kanin vasta-ainetta VHH:ta vastaan ja HRP-konjugoitua sekundaarista vuohen vasta-ainetta kania vastaan. H2O2:n lisääminen yhdessä TMB:n kanssa tunnisti HRP:n määrän muuttumalla värilliseksi tuotteeksi. H2SO4 lisättiin reaktion pysäyttämiseksi. Spektrofotometriset absorptiomittaukset tehtiin 450 nm:ssä levylukijalla (Multiscan GO, ThermoFisher Scientific). Annos-vastekäyrät saatiin sovittamalla logistinen funktio mitattuun dataan yhtälön (4) avulla.
Soluviljely
C2C12-BRE-Luc-soluja kasvatettiin elatusaineessa, joka koostui 20 %:sta (v/v) FBS:stä, 1 %:sta (v/v), 100 U/ml:sta penisilliiniä ja 100 µg/ml:sta streptomysiiniä DMEM:ssä. Soluja kasvatettiin 5 % CO2:ssa 37 °C:ssa, ja väliaine vaihdettiin 2 kertaa viikossa. Kun soluviljelmä saavutti lähes konfluenssin, solut irrotettiin käyttämällä 0,25 % (w/v) Trypsin-EDTA:ta 37 °C:ssa, minkä jälkeen soluja kasvatettiin edelleen tai käytettiin kokeisiin. Entsymaattisesti ristisilloitettuun 5 % (w/v) Dex-TAB:hen kapseloitujen solujen elinkelpoisuus analysoitiin välittömästi kapseloinnin jälkeen (eli päivänä 0) sekä neljän ja seitsemän päivän in vitro -viljelyn jälkeen inkuboimalla soluja 30 minuutin ajan 2 µM kalseiini AM:llä (elävä) ja 4 µM:lla EthD-1:llä (kuollut) PBS:ssä ja visualisoimalla leimatut solut fluoresenssimikroskopialla. Elävä/kuollut-analyysi tehtiin myös soluilla ladattujen Dex-TAB-hydrogeelien jälkimodifioinnin jälkeen neutravidiinilla, D-@BMP7:llä ja B-@BMP7:llä käyttäen samaa valmistuksen jälkeistä funktionalisointiprotokollaa, joka on kuvattu aiemmassa menetelmiä koskevassa jaksossa ”Dex-TAB:n ristisilloittaminen ja ortogonaalinen jälkifunktionalisointi”. Solujen metabolinen aktiivisuus analysoitiin värjäämällä solut käyttämällä 0,5 g l-1 MTT:tä kasvatusmediassa ja sen jälkeen visualisoimalla ne kirkkaankenttämikroskopialla. BMP7-induktiokokeita varten soluja kylvettiin 10 000 solua cm-2 kudosviljelymuoville ja niitä kasvatettiin yön yli. Soluja näännytettiin 0,5 % (v/v) FBS:ää sisältävällä elatusaineella 12 tunnin ajan. Näännyttämisen jälkeen soluviljelmään lisättiin esivalmistettuja Dex-TAB/neutravidiini, Dex-TAB/neutravidiini/D-@BMP7, Dex-TAB/neutravidiini/B-@BMP7 tai biotiinikäsiteltyjä Dex-TAB/neutravidiini/D-@BMP7-hydrogeelikonstruktioita, jotka altistettiin sen jälkeen 100 ng ml-1 BMP7:lle 10-15 tunnin ajan (lisäyskuva 12). Tämän jälkeen solut lysoitiin käyttämällä reportterilyysipuskuria ja yhtä jäädytys-sulatussykliä. Luciferaasi-ekspressio määritettiin valmistajan protokollaa ja luminometriä (Victor X3, Perkin Elmer) noudattaen tehdyllä luciferaasimäärityksellä. Luciferaasi-ekspressio normalisoitiin kokonais-DNA-pitoisuuteen, joka kvantifioitiin käyttämällä QuantiFluor dsDNA System -järjestelmää valmistajan protokollaa noudattaen ja fluorometriä (Victor X3) käyttäen.
Tietojen esittäminen ja tilastointi
HABA:n spektrofotometriset absorptiomittaukset suoritettiin kuudelle näytteelle kutakin olosuhdetta kohti, ja ne raportoitiin keskiarvona ± keskihajonta. SPRi-mittaukset suoritettiin kuudelle pisteelle per ehto, ja ne ilmoitettiin keskiarvona ± keskihajonta (vaaleat viivat). Yksittäisten täplien SPRi-lukemat normalisoitiin neutravidiinin sitoutumiskäyrien Rmax-arvoa vastaan, jotta korjattaisiin erot täplien tiheydessä (täydentävä kuva 1). Supramolekulaaristen vuorovaikutusten kon, koff ja Kd määritettiin vähintään kolmesta SPRi-kokeesta ja ilmoitettiin keskiarvona ± keskihajonta tai yksittäisten datapisteiden päällekkäisyytenä. Fluoresenssilla leimatun streptavidiinin FRAP-mittaukset suoritettiin vähintään neljälle hydrogeelikonstruktiolle olosuhdetta kohti, ja ne ilmoitettiin keskiarvona ± keskihajontana, joka on normalisoitu keskimääräiseen intensiteettiin ennen valkaisua. Fluoresenssin (konfokaali) intensiteettimittaukset (mukaan lukien time-lapse-kokeet) suoritettiin vähintään neljälle hydrogeelikonstruktiolle olosuhdetta kohti, ja ne ilmoitettiin keskiarvona ± keskihajontana tai yksittäisten datapisteiden päällekkäisyytenä, kaikki normalisoituna korkeimpaan keskimääräiseen intensiteettiin. Lineaarinen regressioanalyysi tehtiin OriginPro 2016 -ohjelmistolla. D-FITC:n syrjäyttäminen biotinyloiduilla osuuksilla mitattiin fluoresenssimikroskopialla kymmenestä näytteestä per ehto. Erojen merkitsevyyttä tutkittiin yksisuuntaisella ANOVA:lla ja Tukeyn post-hoc-testillä (tiedot olivat normaalisti jakautuneita, kuten Shapiro-Wilkin testi osoitti: p > 0,1). Fluoresenssilla leimattujen dekstraanimolekyylien, VHH:n ja IgG:n permeaatio Dex-TAB:hen mitattiin neljällä hydrogeelirakenteella per ehto ja ilmoitettiin keskiarvona ± keskihajonta. VHH:n ja IgG:n läpäisevyyden erojen merkitsevyys määritettiin Mann-Whitneyn testillä. Elävien/kuolleiden solujen kvantitatiivinen määritys suoritettiin kolmelle soluilla täytetylle hydrogeelille olosuhdetta kohti, ja se raportoitiin yksittäisten datapisteiden päällekkäisenä keskiarvona. Erojen merkitsevyys määritettiin Kruskal-Wallisin ANOVA-testillä. Annosvasteanalyysit tehtiin kolmella näytteellä konsentraatiota kohti, ja ne raportoitiin keskiarvona ± keskihajonta ja päällekkäisenä sovitettuna logistisena funktiona, joka perustuu yhtälöön (4). Annosvastekäyrien luottamusvälit luotiin automaattisesti kuvaajien piirto-ohjelmalla. C2C12-BRE-Luc-solujen suhteellinen induktio mitattiin kolmesta in vitro -näytteestä olosuhdetta kohti ja ilmoitettiin keskiarvona ± keskihajonta. Erojen merkitsevyys määritettiin Kruskal-Wallisin ANOVA-testeillä.
Skeemat
Kaikki kuvaajat tehtiin OriginPro 2016 -ohjelmistolla. Kaikki kaaviot tehtiin käyttäen ChemDraw Professional 16.0 -ohjelmistoa ja CorelDRAW X7 -ohjelmistoa.
Raportointiyhteenveto
Lisätietoa tutkimussuunnittelusta on saatavilla tähän artikkeliin linkitetyssä Nature Research Reporting Summary -julkaisussa.