Gli effetti della temperatura e dell’umidità relativa sulla vitalità del Coronavirus della SARS

Abstract

La principale via di trasmissione dell’infezione da CoV della SARS si presume siano le goccioline respiratorie. Tuttavia il virus è rilevabile anche in altri fluidi corporei ed escrementi. È stata studiata la stabilità del virus a diverse temperature e umidità relativa su superfici lisce. Il virus essiccato su superfici lisce ha mantenuto la sua vitalità per più di 5 giorni a temperature di 22-25°C e umidità relativa del 40-50%, cioè i tipici ambienti con aria condizionata. Tuttavia, la vitalità del virus è stata rapidamente persa (>3 log10) a temperature più elevate e con un’umidità relativa più alta (ad esempio, 38°C e umidità relativa >95%). La migliore stabilità del coronavirus della SARS a bassa temperatura e bassa umidità può facilitare la sua trasmissione in comunità in zone subtropicali (come Hong Kong) durante la primavera e in ambienti con aria condizionata. Può anche spiegare perché alcuni paesi asiatici in area tropicale (come la Malesia, l’Indonesia o la Tailandia) con alta temperatura e alta umidità relativa non hanno avuto grandi focolai comunitari di SARS.

1. Introduzione

La sindrome respiratoria acuta grave (SARS), è stata una nuova malattia emergente associata a una grave polmonite e si è diffusa fino a coinvolgere oltre 30 paesi in 5 continenti nel 2003. Un nuovo coronavirus è stato identificato come causa. La SARS ha avuto un impatto drammatico sui servizi sanitari e sulle economie dei paesi colpiti, e il tasso di mortalità generale è stato stimato al 9%, ma è salito al 50% nelle persone di 60 anni o più. Una caratteristica notevole di questa malattia è stata la sua predilezione per la trasmissione nell’ambiente sanitario e nei contatti familiari e sociali stretti. Si presume che la malattia si diffonda tramite goccioline, contatti ravvicinati diretti o indiretti, ma l’importanza relativa di queste vie di trasmissione non è attualmente chiara. Uno studio ha dimostrato che la generazione di aerosol virali da parte di un paziente con la SARS era possibile e quindi la trasmissione per via aerea delle goccioline era un possibile mezzo di trasmissione. Tuttavia, il ruolo dei fomiti e della contaminazione ambientale nella trasmissione dell’infezione non è ancora chiaro. Un focolaio di malattia che ha colpito più di 300 residenti in un condominio alto (Amoy Gardens) a Hong Kong non può essere spiegato con la trasmissione di gocce respiratorie da pazienti infetti. Il virus infettivo è rilevabile nelle feci, e l’aerosolizzazione del virus nelle feci contaminate è ritenuta la modalità di trasmissione di questo focolaio.

Noi e altri abbiamo riportato che l’infettività del SARS CoV (SARS coronavirus) è stata persa dopo il riscaldamento a 56°C per 15 minuti, ma che era stabile per almeno 2 giorni dopo l’asciugatura su plastica. Era completamente inattivato dai comuni fissatori usati in laboratorio. Un altro studio ha mostrato che era inattivato dalla luce ultravioletta, da condizioni alcaline (), o acide (). I coronavirus umani hanno dimostrato di sopravvivere in PBS o terreno di coltura con 5-10% FCS per diversi giorni, ma sopravvivono solo poche ore dopo l’essiccazione. Ci sono stati alcuni studi che riportano un’associazione tra l’epidemia di SARS, i fattori metrologici e l’inquinamento atmosferico. Pertanto, le informazioni sulla sopravvivenza del coronavirus della SARS (SCoV) nell’ambiente a diverse condizioni di temperatura e umidità sono di notevole interesse per comprendere la trasmissione del virus. Uno studio recente utilizzando dei coronavirus surrogati (virus della gastroenterite trasmissibile (TGEV) e virus dell’epatite del topo (MHC)) ha indagato l’effetto della temperatura dell’aria e dell’umidità relativa sulla sopravvivenza del coronavirus sulla superficie. Gli effetti di sopravvivenza di questi fattori ambientali sul coronavirus della SARS rimangono poco chiari. Nel presente studio, riportiamo la stabilità del coronavirus della SARS a diverse temperature e umidità relativa.

2. Materiale e metodi

2.1. Ceppo del virus e linea cellulare

Il ceppo di SARS CoV usato in questo studio è HKU39849. Le cellule fetali di rene di scimmia (FRhK-4) sono state coltivate in terreno essenziale minimo (MEM, Gibco, USA) con 10% di siero fetale di vitello e penicillina streptomicina (Gibco, USA) a 37°C in 5% CO2 e sono state utilizzate per la crescita di stock di virus e per la titolazione dell’infettività virale.

2.2. Preparazione del virus stock

Il virus stock è stato raccolto quando l’infezione circa il 75% del monostrato di cellule di un pallone infettato dal virus ha manifestato un effetto citopatico (CPE). Le cellule infette sono state sottoposte a un ciclo di congelamento e scongelamento centrifugato a 2000 rpm per 20 minuti per rimuovere i detriti cellulari e il surnatante della coltura è stato aliquotato e conservato a -80°C fino all’utilizzo.

2.3. Determinazione della dose infettiva della coltura dei tessuti (50%) (TCID50)

96 piastre da microtitolazione contenenti 100 μL di FRhK-4 confluenti sono stati infettati con 100 μL di serie 10 volte di diluizioni di virus stock in terreno essenziale minimo con 1% FCS (terreno di mantenimento) a partire da 10-1 a 108. Le titolazioni sono state fatte in quadruplicato. Le cellule infettate sono state incubate per 4 giorni a 37°C. La comparsa di CPE è stata registrata ogni giorno. Il TCID50 è stato determinato secondo Reed e il metodo Muench.

2.4. Effetto dell’essiccazione, del calore e dell’umidità relativa

Dieci microlitri di terreno di mantenimento contenente 107 TCID50 per mL di virus sono stati posti in pozzetti individuali di piastre di plastica a 24 pozzetti e lasciati asciugare a temperatura ambiente (22~25°C) e umidità relativa del 40-50% (cioè le condizioni prevalenti in una tipica stanza con aria condizionata). Cento microlitri di MM sono stati utilizzati per risospendere il virus a 0 ore, 3 ore, 7 ore, 11 ore, 13 ore, 24 ore, e fino a 4 settimane e l’infettività virale residua è stata titolata. I controlli in provetta eppendorf con tappo a vite chiuso sono stati inclusi ogni volta e trattati in modo simile ma senza essiccazione.

L’esperimento è stato ripetuto a diverse temperature (38°C, 33°C, 28°C) e umidità relativa (>95%, 80~89%) per 3 ore, 7 ore, 11 ore, 13 ore, e 24 ore. Un nebulizzatore in condizioni controllate è stato utilizzato per generare un ambiente ad alta e bassa umidità relativa. Tutti gli esperimenti di cui sopra sono stati condotti in duplicato e l’infettività virale residua è stata titolata.

2.5. Saggio di infettività

L’infettività del virus residuo è stata titolata in quadruplicato su piastre da microtitolazione a 96 pozzetti contenenti 100 μL di cellule FRhK-4 confluenti. Nelle cellule FRhK-4 sono stati aggiunti 100 μL di diluizioni seriali di 10 volte di virus nel terreno di mantenimento a partire da 10-1 a 108. Le cellule infettate sono state incubate a 37°C per 4 giorni. La comparsa di CPE è stata registrata quotidianamente. Il TCID50 è stato determinato secondo il metodo Reed e Muench.

3. Risultati

Dieci microlitri di 107 TCID50 per mL di virus sono stati posti in singoli pozzetti di una piastra di plastica a 24 pozzetti (che rappresenta una superficie non porosa) e asciugati. Il virus essiccato è stato poi incubato a diverse temperature (38°C, 33°C, 28°C) a diverse umidità relative (>95%, 80~89%) per 3 ore, 7 ore, 11 ore, 13 ore e 24 ore e l’infettività virale residua è stata titolata. Un esperimento simile è stato condotto a temperatura ambiente e umidità relativa di circa il 40-50% (stanza con aria condizionata) per un massimo di 4 settimane. Il virus essiccato su plastica ha mantenuto la vitalità fino a 5 giorni a 22~25°C con un’umidità relativa del 40~50% con solo la perdita del titolo (Figura 1). Dopo che l’infettività del virus è gradualmente perso sempre tempo. La perdita di infettività del virus in soluzione era generalmente simile al virus essiccato in queste condizioni ambientali. Questo indica che il SARS CoV è un virus stabile che può potenzialmente essere trasmesso per contatto indiretto o tramite fomiti, specialmente in ambienti con aria condizionata.

Figura 1

Infettività residua del virus a 22-25°C con umidità relativa 40-50% (titolo iniziale 105/10 μL) e a 33°C o 38°C con umidità relativa >95%.

L’alta umidità relativa (>95%) a temperature relativamente basse (28°C e 33°C) non ha influenzato significativamente l’infettività del virus (Figura 2(a)). L’alta temperatura (38°C) all’80-90% di umidità relativa ha portato ad una perdita di titolo di 0,25~2 a 24 ore (Figura 2(b)). Tuttavia, se il virus essiccato è stato conservato ad alta temperatura (38 ° C) e alta umidità relativa (>95%), c’era un ulteriore ~ 1,5 perdita di titolo per ogni punto di tempo fino a 24 ore (0,38 ~ 3,38 ) rispetto all’alta temperatura (38 ° C) ad una minore umidità relativa 80-90% (figure 3 (a) -3 (c)).

(a)

(b)

(a)
(b)

Figura 2

Infettività del SARS Coronavirus (105/10 μL) a diverse temperature a (a) >95% umidità relativa, (b) >80-89%.

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Figura 3

Infettività del SARS Coronavirus (titolo iniziale 105/10 μL) a diversa umidità relativa a (a) 38°C, (b) 33°C, e (c) 28°C.

4. Discussione

I virus non si replicano al di fuori delle cellule viventi, ma il virus infettivo può persistere su superfici ambientali contaminate e la durata della persistenza del virus vitale è influenzata notevolmente dalla temperatura e dall’umidità. Le superfici contaminate sono note per essere vettori significativi nella trasmissione delle infezioni nell’ambiente ospedaliero e nella comunità. Il ruolo dei fomiti nella trasmissione del RSV è stato chiaramente dimostrato. La sopravvivenza dei virus su una varietà di fomiti è stata studiata per virus influenzali, paramyxovirus, poxvirus e retrovirus. Il coronavirus umano associato al comune raffreddore è stato segnalato per rimanere vitale solo per 3 ore sulle superfici ambientali dopo l’essiccazione, anche se rimane vitale per molti giorni in sospensione liquida. I virus Parainfluenza e RSV erano vitali dopo l’essiccazione sulle superfici per 2 e 6 ore, rispettivamente. In forma aerosolizzata, il coronavirus umano 229E è generalmente meno stabile in alta umidità. La stabilità ambientale di SCoV era precedentemente sconosciuta e questa informazione è chiaramente importante per comprendere i meccanismi di trasmissione di questo virus in un ambiente ospedaliero e comunitario.

Nel presente studio, abbiamo dimostrato che il SARS CoV può sopravvivere almeno due settimane dopo l’essiccazione alle condizioni di temperatura e umidità presenti in un ambiente climatizzato. Il virus è stabile per 3 settimane a temperatura ambiente in un ambiente liquido, ma viene facilmente ucciso dal calore a 56°C per 15 minuti. Questo indica che il CoV della SARS è un virus stabile che può potenzialmente essere trasmesso per contatto indiretto o tramite fomiti. Questi risultati possono indicare che le superfici contaminate possono giocare un ruolo importante nella trasmissione dell’infezione in ospedale e nella comunità.

I nostri studi indicano che SCoV è relativamente più stabile dei coronavirus umani 229E o OC43 e di alcuni altri patogeni respiratori virali come il virus respiratorio sinciziale. Questi risultati suggeriscono che, mentre la trasmissione diretta delle gocce è un’importante via di trasmissione, il ruolo dei fomiti e della contaminazione ambientale nella trasmissione del virus può svolgere un ruolo significativo nella trasmissione del virus. In particolare, i fomiti possono contribuire alla continua trasmissione dell’infezione nell’ambiente nosocomiale che continua a verificarsi nonostante la grande attenzione e le rigorose precauzioni adottate per prevenire la diffusione delle gocce. Oltre alle precauzioni per le gocce, è necessario rafforzare le precauzioni di contatto e il lavaggio delle mani.

La contaminazione fecale del coronavirus SCoV può quindi essere una via efficace di trasmissione della malattia. L’epidemia di Amoy Garden a Hong Kong, che ha colpito oltre 300 residenti in un blocco di appartamenti singoli, si pensa sia stata trasmessa da acque reflue contaminate. La stabilità del virus sulle superfici ambientali e la sua presenza nelle feci indica il potenziale che la contaminazione fecale della produzione di alimenti freschi può costituire una minaccia per la trasmissione del virus, soprattutto nei paesi con scarse condizioni igieniche e sistemi di smaltimento delle acque reflue e che sono necessari studi per affrontare questa possibilità.

In questo studio, abbiamo dimostrato che l’alta temperatura ad alta umidità relativa ha un effetto sinergico sull’inattivazione della vitalità del SARS CoV mentre le temperature più basse e la bassa umidità favoriscono la sopravvivenza prolungata del virus sulle superfici contaminate. Le condizioni ambientali di paesi come la Malesia, l’Indonesia e la Thailandia non sono quindi favorevoli alla sopravvivenza prolungata del virus. In paesi come Singapore e Hong Kong, dove c’è un uso intensivo dell’aria condizionata, la trasmissione si è verificata soprattutto in ambienti ben climatizzati come ospedali o alberghi. Inoltre, uno studio separato ha dimostrato che durante l’epidemia, il rischio di una maggiore incidenza giornaliera della SARS era 18,18 volte maggiore nei giorni con una temperatura dell’aria più bassa rispetto ai giorni con una temperatura più alta a Hong Kong e in altre regioni. Prese insieme, queste osservazioni possono spiegare perché alcuni paesi asiatici in zona tropicale (con alta temperatura e alta umidità relativa) come la Malesia, l’Indonesia e la Thailandia non hanno avuto focolai nosocomiali di SARS (Tabelle 1 e 2(a)-2(c)). Può anche spiegare perché Singapore, che si trova anch’esso in un’area tropicale (Tabella 2(d)), ha avuto la maggior parte dei suoi focolai di SARS negli ospedali (ambiente con aria condizionata). È interessante notare che durante l’epidemia di SARS a Guangzhou, i medici hanno tenuto le finestre delle stanze dei pazienti aperte e ben ventilate, il che potrebbe aver ridotto la sopravvivenza del virus e quindi la trasmissione nosocomiale. Il virus della SARS può mantenere la sua infettività fino a 2 settimane in un ambiente a bassa temperatura e bassa umidità, il che potrebbe facilitare la trasmissione del virus nella comunità, come a Hong Kong che si trova in una zona subtropicale (Tabella 2(e)). Altri fattori ambientali, tra cui la velocità del vento, la luce solare giornaliera e la pressione dell’aria, che hanno dimostrato di essere associati all’epidemia di SARS, dovrebbero essere considerati. La dinamica dell’epidemia di SARS coinvolge molteplici fattori tra cui le proprietà fisiche del virus, gli ambienti esterni e interni, l’igiene, lo spazio e le predisposizioni genetiche. Comprendere la stabilità dei virus in diverse condizioni di temperatura e umidità è importante per comprendere la trasmissione di nuovi agenti infettivi, compresa quella della recente influenza apandemica H1N12009.

Conflitto di interessi

Gli autori dichiarano che non c’è conflitto di interessi.