Amikor már azt hiszed, hogy megtaláltad a tökéletes fixálószert a szövetedhez, van még valami, amit figyelembe kell venned – lehet, hogy a fixálószer elfedte az összes antigénhelyet, amelyhez a szép új antitested kötődni fog!
Megfedte az antigént?
Amint egyik korábbi cikkemben említettem, a választott fixálási technika általában keresztkötéseket hoz létre a fehérjékben; ez az egyik módja a szövet stabilizálásának. Ez megváltoztathatja a fehérje biokémiáját oly módon, hogy az érdeklődésre számot tartó antigén elmaszkírozódik, és az Ön elsődleges antitestje már nem fogja felismerni.
Ne aggódjon – a segítség kéznél van!
Az antigén maszkolását nemcsak az epitópon belüli aminosavak keresztkötése okozhatja, hanem az epitópon vagy annak közelében lévő, nem kapcsolódó peptidek keresztkötése, az epitóp konformációjának megváltoztatása vagy az antigén elektrosztatikus töltésének megváltoztatása is. Mivel az antigén-antitest felismerés a fehérje szerkezetén múlik, fontos, hogy megpróbáljuk helyreállítani a természetes 3-D szerkezetet. Ne aggódjon- számos technika áll rendelkezésre, hogy ezt áthidalja.
Vegye le a maszkot!
Egyes antitestek nem igényelnek semmiféle maszkmentesítést, de ha a magáé igen, ne essen pánikba- ez csak egy rövid kiegészítés a szokásos protokollhoz. Az antigén-visszanyerés kifejezés minden olyan technikára utal, amely során egy epitóp maszkolását visszafordítjuk, és az epitóp-antitest kötődést helyreállítjuk. Az antigén-visszanyerés típusa számos változótól függ, többek között a célantigéntől, a felhasznált antitesttől, a szövet típusától és a szövet megőrzéséhez használt rögzítési módszertől. Ha például poliklonális antitestet használ, amely több epitópot ismer fel, akkor kevésbé valószínű, hogy antigén-visszanyerésre van szükség, de valószínűleg egy kis plusz háttérrel is jár. Ha olyan fixálási technikát használt, mint például az etanol, akkor az antigén-visszanyerés nem ajánlott, mivel a fixálás nem biztos, hogy elég erős ahhoz, hogy kezelje a visszanyerési körülményeket.
Hő vagy enzimek – Ön választ
Ez epitóp immunreaktivitásának visszaállítására többféle technika létezik, és ezek általában két fő kategóriába sorolhatók; (a) enzimekkel indukált antigén-visszanyerés és (b) hővel indukált antigén-visszanyerés. Mindkét kategórián belül is számos különböző módja van a visszanyerésnek.
Enzimindukált módszerek
Az enzimindukált módszerekben olyan enzimek, mint a proteináz K, a tripszin és a pepszin használhatók az antitest epitóphoz való kötődésének helyreállítására. A hatásmechanizmus feltételezhetően az epitópot esetleg elfedő peptidek hasítása. A főbb enzimes módszerek, amelyek 10-20 perces inkubációt igényelnek 37?C-on, a következők:
- Proteináz K (20 g/ml TE pufferben, pH 8)
- Tripszin (0,5% dH20-ban)
- Pepszin (0,1% 10 mM HCl-ben)
- Pronáz (0,5 vagy 0,5 vagy 0.1% dH20-ban)
- Proteáz (0,5% dH20-ban)
Attól függően, hogy melyik módszert választja, mindegyiket a különböző szövettípusokhoz és antitestekhez kell optimalizálni, de mindegyik módszer a blokkolás előtt és a viaszmentesítés utáni lépésekbe illeszthető. Ezeknek a módszereknek a hátránya az immunreaktivitás helyreállításának alacsony sikerességi aránya, valamint az, hogy mind a szöveti morfológiát, mind az érdeklődésre számot tartó antigént tönkretehetik.
Ha az enzimindukált módszert túl durvának találja, vagy egyszerűen nem válik be, akkor megpróbálkozhat a hőindukált módszerrel. Ez a módszer feltehetően visszafordít néhány keresztkötést, és lehetővé teszi az epitóp másodlagos vagy harmadlagos szerkezetének helyreállítását. Ez lényegében a rögzített fehérjék szerkezetének újrateleltetése egy sor konformációs változáson keresztül.
Hőindukált módszerek
Ez magában foglalhatja a formalinnal indukált keresztkötések lehetséges hidrolízisét (felbontását), az egész folyamatot a hőforrásból származó hőenergia hajtja. Az enzimindukált módszerekhez hasonlóan a hőindukált módszerek is optimalizálást igényelnek. Ezek a módszerek, amelyekhez 10-40 percig kell gőzölni, mikrohullámú sütőben (öt perces lépésekben) vagy vízfürdőben 95-100 °C-on, majd 20 percig szobahőmérsékleten hűteni, a következők:
- Citrát puffer (10 mM nátrium-citrát, 0,05% Tween 20, pH 6)
- Citrát-EDTA puffer (10 mM nátrium-citrát, 2 mM EDTA, 0.05% Tween 20, pH 6,2)
- EDTA (1 mM EDTA, 0,05% Tween 20, pH 8)
- Tris-EDTA (10 mM Tris Base, 1 mM EDTA, 0,05% Tween 20, pH 9)
- Glycin-EDTA (50 mM Glycine-HCl, 0.01% EDTA, pH 3,5)
Általánosságban elmondható, hogy a hőindukált módszereket szélesebb körben használják, valószínűleg azért, mert sikeresebbek. Ha csak most kezdjük az antigén-visszanyerést, akkor jó kiindulópont lehet a citrátpufferes visszanyerés jól bevált módszere. Természetesen, ha ez nem működik, akkor utána még bőven van mit kipróbálnod.
Segített ez neked? Akkor kérlek, oszd meg a hálózatoddal.