2 Life History
FBF cercariaeは微細で、形態的に同定が難しく、通常、無脊椎動物中間ホスト集団の中での感染率は極めて低い (Cribb et al., 2011)。 淡水産のSanguinicola属の数種（Bullard and Overstreet, 2008参照）と海洋産のAporocotyle simplex（Køie, 1982; Køie and Petersen, 1988, 実験感染；分子マーカーの適用なし）, Paracardicoloides yamagutii（Nolan and Cribb, 2004a参照；後述）, C. FBFの一部を除くすべての種について，中間宿主が不明であると思われる。 forsteri (Cribb et al, 2011; 後記参照）、Cardicola opisthorchis（杉原ら, 2014; 後記参照）。 ITS2 rDNA配列は、無脊椎動物宿主から採取した形態的に不定なFBF幼虫標本、すなわち、cercariae、sporocyst、rediaeと同系統の魚類宿主の形態的に特徴ある成虫標本との照合に使用されてきた。 分子マーカーは、迅速かつ安価に感染を検出することができ、系統的推論あるいは既に配列が決定されている分類群との相同性によって感染病原体を同定し、中間宿主を同定して、潜在的病原性FBFの生活史段階を関連付けることが可能である。 確かに、中間宿主と最終宿主の同定は、FBFの生活環を理解する上で重要な第一歩となる。 しかし、FBFと多毛類、腹足類、二枚貝の中間宿主との宿主-寄生関係の詳細については、診断的アプローチ以外にも、まだ多くのことが分かっていない。 FBFの進化の歴史は、これらの中間宿主によって、最終宿主と同じかそれ以上に影響を受けている可能性があるのだ。 そのため、分子研究は、未熟な無脊椎動物および魚類の宿主に暴露した後に、宿主組織内の幼虫および成虫のFBFを直接顕微鏡で観察する古典的な実験研究に完全に取って代わるべきものではないと主張する（Køie、1982）。 GenBankで利用可能なFBF配列の109のうち17（16％）が海洋水産養殖における感染に由来する（表1.1）。 FBFは、成虫として血管を閉塞し窒息死を引き起こす、卵として鰓上皮と鰓管を損傷または閉塞する、そして鰓上皮に埋め込まれた卵から孵化し魚の外に出てくる奇胎として、そのメンバーが最終的な宿主に害を与える数少ないトレマトード群の1つである (Bullard and Overstreet, 2002, 2008)。 このように、FBF は淡水池、競走路、沖合の海洋ケージにおいて魚を死亡または衰弱させ、経済的損失をもたらす可能性があるため、そのライフサイクルは商業養殖事業にとって懸念すべきものである。 FBFの無性生殖ステージ（胞子嚢、赤虫、幼虫）を保有する腹足類、二枚貝、多毛類宿主に感染した非成体FBFから得られた配列は、魚類宿主に感染した成体標本からの配列よりもはるかに数が少なく（109のうち4）（表 1.1 ）。
分子的手法によるFBFのライフサイクル研究で初めて発表されたNolan and Cribb (2004a) は、オーストラリアのクイーンズランドの潮流クリークにおいて、水生腹足類Posticobia brazieriの11,314検体中80検体に2種類のサーカリア形態（「タイプA」および「タイプB」）の感染が確認されたと報告している。 A型セルカリアのITS2 rDNA配列は、斑点ウナギAnguilla reinhardtiiの血液（背側大動脈、心房、心室、エラ、腎臓、腸管、膀胱の血管）から採取したP. yamagutiiの成虫標本と一致した（100％一致）。 別の研究では、南オーストラリア沖の養殖ミナミマグロ T. maccoyii に感染した C. forsteri の感染症に関する懸念を受けて、Cribb ら（2011）は FBF 感染症について 11 の二枚貝、2 の腹足類、24 の多毛類の 9351 個体についてスクリーニングを実施した。 Longicarpus modestus（多毛類：Terebellidae）に感染したケルカリアから得られたITS2 rDNA配列データは、オーストラリア・ポートリンカーンのネットペンで近傍のミナミマグロの心臓から得られたC. forsteriの成魚標本と100％一致した。 また、L. modestusに感染したC. forsteriのケルカリアから28S rDNA断片（D1-D2領域721 bp）の塩基配列を決定した。 杉原ら（2014）は，Cribbら（2011）のアプローチに続き，多毛類に着目し，南日本沖の太平洋クロマグロThunnus orientalisの養殖場におけるFBF感染について744の無脊椎動物を調査した。 底質から採取したフジツボの死骸の殻内や海底かごの下のロープや浮き輪から採取した小児多毛類（Terebella）の5個体にFBFの胞子嚢と幼虫が検出された。 胞子嚢のITS2および28S配列は、養殖クロマグロの心臓から採取したC. opisthorchisの成虫の配列と100%一致した。
Shirakashi et al. (2012) は、太平洋クロマグロのCardicola orientalisおよびC. opisthorchisの同時感染について検討した。 彼らはITS2 rDNAの配列データを用いて、求心性フィラメント動脈に感染するC. opisthorchisの三日月形の卵と鰓孔に感染するC. orientalisの卵形の卵を区別することができた。 彼らは、種特異的PCRプライマーを鰓の組織サンプルに適用することで、病理組織学を補完し、卵や成虫が光学顕微鏡で容易に観察できるほど多くなる前に感染症を診断するのに役立つと述べている。 Yongら（2013）は、ITS2 rDNAの完全な配列データを用いて、グレートバリアリーフの5種のチョウチョウウオ（Perciformes: Chaetodontidae）の鰓に宿るFBF卵を単一種Cardicola chaetodontis（2サンプルで1塩基対違い）と同定した。 FBFの卵は、通常の魚の剖検で鰓上皮や分枝動静脈に観察されることが少なくないが（SAB、私見）、多くの場合、魚個体の血液に感染する対応する成虫標本が回収されない。 例えば、C. chaetodontisの卵は全長40〜60μmと微小であるが、FBFの卵から効果的にDNAを抽出・増幅する分子生物学的手法は、得られた塩基配列を同定種からの配列と系統的に並べていけば、未同定種のFBFやこれまで文書化されていなかった宿主が明らかになると期待される。 同じことが、幼虫から得られた配列にも言える（後述）。 Norte Do Santosら（2012）は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）を用いて、蓄養されたミナミマグロの鰓に凝集したC. forsteriの卵を同定している。 同様に，Kirchhoffら（2012）は，T. maccoyiiに感染したC. forsteriの卵を診断するためにこの方法を適用した。 Polinskiら（2013）は、非致死的サンプルにおけるC. forsteri、C. orientalis、C. opisthorchisの同定にも使用できる感度と精度の高いリアルタイムPCR技術を開発し、このアプローチをさらに一歩進めました。 SYBRベースのqPCRと共通のレポーターTaqManアッセイのいずれの方法でも、種を超えた増幅や宿主ゲノム増幅は検出されなかったが、これらを併用することで種の鑑別の信頼性は向上した。 これらの手法により，T. maccoyiiにおけるC. forsteriとC. orientalisの同時感染が確認され，宿主におけるC. orientalisの高い有病率と分布が示された。
最近，FBF感染の病的影響を評価するために，開発した両方の手法の有用性が支持された。 Polinskiら（2014）はqPCRと宿主遺伝子免疫転写を組み合わせ、C. opisthorchisとC. orientalisに感染した組織からDNA量を定量化した。 彼らはまた、ケージに入れられた太平洋クロマグロにおけるこれらの感染に対する時間的な宿主免疫反応も定量化した。 これまでのデータでは、C. orientalis の成虫と卵は鰓に感染し (Ogawa et al., 2010; Shirakashi et al., 2012) 、一方 C. opisthorchis の成虫と卵はそれぞれ心臓と求心性枝動脈に感染した (Ogawa et al., 2011; Shirakashi et al., 2012)。 しかし，Polinskiら（2014）の結果では，鰓の組織における大量の「C. orientalis only」感染とIgM転写の相関が見られたが，C. opisthorchisのDNAとの相関は見られなかったことから，この器官におけるこの種の免疫反応は，卵ではなく成虫の存在が引き金となる可能性が示唆された． さらに、心臓に存在する高レベルのC. orientalisのDNAは、幼若フルクの存在に起因するものであった。 このような方法では、FBFの生活史段階やフルクの生死を特定することはできないが、この定量的アプローチにより、感染強度や感染状況を推測することができ、それ自体が今後の野生魚や養殖魚を用いた疫学研究にとって有望な手段であると言える。
Brantら（2006）は、ウガンダ、ケニア、オーストラリアの腹足類（PlanorbidaeとThiaridae）から分離されたいくつかの未同定のFBFと思われるcercariaeについて、系統推定（28S、18S、COI）を用いて検討した。 その結果、ウガンダ、ケニア、オーストラリアの腹足類（PlanorbidaeおよびThiaridae）から分離されたFBFと推定される数種類の幼虫について、顕微鏡写真、眼点の有無、幼虫尾部と体部のひだ、尾部の形状から形態学的に判定し、FBFと推定される幼虫を特定した。 FBFの形態学的な定義（診断）は一貫しておらず、系統学的に首尾一貫しているが、これらの幼虫は典型的に特徴的である：微細、フォークテール、腹部吸盤がなく、特殊な前部吸盤からなると思われる独特の貫通器官があり (Truong and Bullard, 2013) 、幼虫本体にひれがあり、尾部にひれが存在するかしない (Cribb et al., 2011)． このうち、W5004は特に形態的に奇妙であり、すなわち、咽頭・毛包性であるが「贅沢な側尾膜と尖った体型」と記載されており、FBFの典型的な特徴をすべて備えた個体はいなかった（前文参照）。 しかし、これらの幼虫の18Sと28Sの複合解析により、他のFBF配列とクラスター化した（「Sanguinicolid sp.」は「Sanguinicola cf. inermis」（AY222180）のものと推定される）。 そのため、また既知のFBFサーカリアと比較して形態的に奇妙であることから、著者らはFBFサーカリアの形態的多様性はこれまでの文献で認識されているよりもはるかに大きいと仮定している。 これらの配列の分類学的同一性と系統学的意義については、本文でさらに詳しく述べる
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