Cultura cellulare
Le cellule del rene embrionale umano 293FT (HEK293) sono state coltivate in DMEM integrato con 10% FBS e 1% penicillina/streptomicina (100 iU per ml; 100 μg per ml). Le linee cellulari non sono state autenticate. Le cellule erano prive di micoplasmi. Le cellule sono state incubate in un’atmosfera umidificata al 5% di CO2 a 37 °C. Per le linee cellulari stabili, le cellule trasfettate sono state selezionate in presenza di puromicina (3 μg per ml). Per gli studi di trasfezione transitoria, le cellule HEK293 sono state seminate in piastre da 6 pozzetti in presenza dei vettori utilizzando Lipofectamin2000 (ThermoFisher). Linee cellulari podociti sono stati stabiliti da urina umana42 e APOL1 genotipizzazione è stata eseguita, dopo aver ottenuto il consenso informato sotto protocolli di ricerca (94-DK-0127, 94-DK-0133) approvato in anticipo dal NIDDK Institutional Review Board. Il caso A è G0/G0 maschio con FSGS, il caso B è G0/G0 maschio con FSGS associato all’HIV, il caso C è G0/G0 maschio con FSGS (HP55-345O-1), il caso D è G1/G2 maschio con FSGS, e il caso E è G1/G2 maschio con FSGS associato all’HIV. Le cellule sono state coltivate in RPMI1640 integrato con 10% FBS, ITS, e 1% penicillina/streptomicina (100 iU per ml; 100 μg per ml). Le cellule sono state incubate in un’atmosfera umidificata al 5% di CO2 a 33 °C e differenziate a 37 °C per 7-10 giorni. Le linee cellulari non sono state autenticate. Le cellule erano prive di micoplasma. Prima di raccogliere i lisati cellulari, le cellule sono state trattate con 103 U per ml IFNα (Abcam) per 24-72 h e 100 mM calyculin A (LC Laboratories) per 30 min. Per gli esperimenti di inibizione della PKR, le cellule sono state trattate con 1 μM di inibitore imidazolo-ossindolo PKR C16 (Sigma Aldrich) per 1 h43.
Tessuto umano
I tessuti di biopsia renale umana deidentificati sono stati ottenuti dalla dottoressa Preeti Chandra, Università del Maryland. La ricerca è stata approvata in anticipo dagli Institutional Review Boards dell’Università del Maryland e del NIDDK, NIH.
Informazioni sul plasmide
Il vettore di espressione APOL1 G0 consiste nel cDNA APOL1 umano derivato dal promotore CMV (NM_001136540: 298-1453). Per APOL1 G1 (rs73885319 A→G e/o rs60910145 T→G) e G2 (rs71785313 del), è stata eseguita la mutagenesi sito-diretta. Per il vettore di espressione APOL1 privo di espressione proteica è stato prodotto inserendo un codone di stop e una sequenza frameshift (TAATAGATGA) dopo il codone 138. Per il vettore di mutazione della struttura secondaria, le sequenze originali sono alterate da otto cambiamenti sinonimi (NM_001136540: 1195A→T, 1196G→C, 1197C→G, 1203A→T, 1209G→A, 1221G→A, 1224C→G, e 1242T→C). Per il vettore stabile dsRNA G0 le sequenze originali sono alterate da 5 mutazioni nel 3′ UTR (CCA CAG GGC AGG GCA GCC ACC AGGA GAT ATG CCT GGC AGG GGC CAG G→CCA CAG GGC AGG CCA GCC ACC AAG AAA GAT ATG CTT GAC AGG GGC CAG G). Per l’RNA di accompagnamento intorno agli alleli APOL1 (NM_001136540.1, 1031-1453), pRNAT-CMV3.2/Puro (GeneScript) è stato usato come vettore di fondo. Gli schemi delle mappe vettoriali sono in Figura supplementare 1.
Immunoblotting
Le cellule sono state lisate in un tampone RIPA contiene cocktail di inibitore della proteasi/fosfatasi. I lisati sono stati separati mediante elettroforesi su gel SDS-poliacrilamide e le proteine sono state sottoposte a western blotting e bloccate per 30 minuti in tampone di blocco Odyssey (LI-COR). I blot sono stati incubati con anticorpi primari contro APOL1 (Sigma Aldrich HPA018885), fosfo-eIF2α (Cell Signaling Technology #9721), eIF2α (Cell Signaling Technology #5324), β-Actina (Santa Cruz Biotechnology Inc. sc-47778), HRI (Upstate #07-728), fosfo-PKR (Santa Cruz Biotechnology Inc. sc-101784), PKR (abcam ab45427), fosfo-PERK (Cell Signaling Technology #3179), PERK (Cell Signaling Technology #5683), fosfo-GCN (Abcam ab75836), e GCN (Cell Signaling Technology #3302), LC3 (Abcam ab168803) e p62 (Cell signaling #5114). I blot sono stati incubati con anticorpo anti-rabbit marcato con colorante (LI-COR). Tutti i blot sono stati ripresi utilizzando lo scanner a infrarossi Odyssey (LI-COR). Le immagini grezze del gel sono mostrate nella figura supplementare 13.
PCDR con trascrittasi inversa e PCR quantitativa in tempo reale
Le cellule o il rene totale sono stati raccolti nel reagente TRIzol e l’RNA totale è stato isolato. L’RNA totale è stato trattato con DNasi prima della sintesi del cDNA con oligo (dT). Un’aliquota di 5 μg di RNA è stata usata per la sintesi di cDNA con la trascrittasi inversa Superscript II. I campioni sono stati analizzati mediante PCR (RT) o RT-PCR quantitativa (qRT-PCR) utilizzando la miscela master Power SYBR Green PCR (ThermoFisher). L’espressione relativa in ogni campione è stato calcolato come un rapporto (gene specifico attamoles per β-actina). Le coppie di primer sono elencate nella tabella supplementare 1.
Saggio di sintesi proteica
Le cellule HEK293 trasfettate o le linee cellulari di podociti umani sono state coltivate in piastre da 96 pozzetti e sono state trattate con 103 U per ml IFNα (Abcam) per la quantificazione o il vetrino da camera per la visualizzazione. Il saggio di sintesi (Click-iT AHA Alexa Fluor 488 Protein Synthesis HCS Assay, catalogo no. C10289, Invitrogen) è stato eseguito secondo le istruzioni del produttore. La controcolorazione nucleare è stata eseguita con Hoechst. Le cellule HEK293 senza vettore trattate con 1 μM di puromicina (InvivoGen, San Diego, CA) sono state utilizzate come controllo negativo per questo test, con sfondo impostato allo 0% di intensità del segnale. Le cellule HEK293 con il vettore APOL1 G0 sono state impostate al 100% di intensità del segnale.
Vitabilità cellulare
I saggi di vitalità cellulare sono stati eseguiti utilizzando saggi ATP. Per quantificare l’ATP generato dalle cellule metabolicamente attive, abbiamo usato un test di vitalità cellulare luminescente CellTiter-Glo (Promega) secondo le istruzioni del produttore. Le cellule sono state coltivate in piastre sterili a 96 pozzetti in presenza di 103 U per ml di IFNα (Abcam) per 72 ore, e poi sono stati aggiunti 100 μL di reagente CellTiter-Glo per lisciare le cellule. Dopo un’incubazione di 10 minuti a temperatura ambiente, la luminescenza è stata rilevata utilizzando un luminometro con un tempo di integrazione di 1 s per pozzetto. I segnali di luminescenza per le cellule sono stati normalizzati dal conteggio delle cellule.
Saggio di velocità di proliferazione cellulare
Le cellule sono state seminate a 5,0 × 103 cellule per 150 µL di terreno di coltura in ogni pozzetto della piastra a 96 pozzetti e l’inibitore PKR C16 è stato aggiunto alla concentrazione indicata. Dopo 0, 24, 48, 50 µL, il numero di cellule è stato misurato con Cell Counting Kit-8 (Sigma-Aldrich).
Tassi di consumo di ossigeno in podociti umani coltivati
L’analizzatore di flusso extracellulare XF24 (Seahorse Bioscience, Billerica, MA) è stato utilizzato per valutare i tassi di consumo di ossigeno cellulare (OCR) secondo le indicazioni della società. Brevemente, i podociti umani coltivati sono stati seminati in piastre XF24 bene acquistati da Seahorse Bioscience, ad una densità di 2,0 × 104 cellule per pozzetto (superficie 0.33 cm2) in 100 μL di terreno di coltura e sono stati incubati una notte a 37 ° C. Il giorno seguente, le cellule sono state trattate con IFNα (1 × 103 U per ml) con/senza inibitore PKR C16 (100 nM) per 72 h, seguito da 24 h di trattamento sulle piastre XF24. Prima di misurazioni OCR, la piastra sperimentale XF24 contenente le cellule è stato lavato con bicarbonato-free DMEM assay medium (Seahorse Bioscience) contenente 25 mM glucosio e 1 mM piruvato di sodio, e le cellule sono state preincubate per 1 h a 37 ° C senza una fornitura di CO2 in 625 micron di terreno di saggio. Prima di misurazioni OCR, il XF24 è stato calibrato utilizzando una cartuccia di calibrazione secondo le indicazioni della società. Dopo la calibrazione, misurazioni OCR linea di base sono stati condotti nella piastra di prova per 4 min.
RNA-immunoprecipitazione (RNA-IP)
Cellule HEK293 stabili con la variante APOL1-G0, G1, o G2 sono stati mock-trattati con il seguente: (a) 103 U per ml IFNα per 24-72 h e 100 μM di acido palmitico (Sigma) per 2 h, o (b) 100 mM 103 U per ml IFNα per 24-72 h e calyculin A per 30 min. L’acido palmitico si lega direttamente alla PKR e inibisce il legame del dsRNA alla PKR44 e quindi l’acido palmitico è stato usato come controllo negativo. Le cellule sono state irradiate con luce UV a 200 mJ per cm2. Il dieci per cento di ogni lisato cellulare è stato salvato per servire come campione di input per la RT-qPCR. L’immunoprecipitazione è stata eseguita utilizzando il kit di immunoprecipitazione della proteina RNA-Binding (EMD Millipore) sulla base della precedente relazione utilizzando PKR45. L’anticorpo Phospho-PKR (Santa Cruz Biotechnology, sc-101784) o le IgG di coniglio di controllo sono state utilizzate per la RNA-IP. L’RNA è stato estratto con TRIzol, seguito dal trattamento DNase e dalla precipitazione con etanolo. I cDNA sono stati generati usando primer random hexamer e SuperScript Reverse transcriptase II. I campioni sono stati analizzati mediante PCR (RT) o qRT-PCR utilizzando Power SYBR Green PCR master mix (ThermoFisher). L’arricchimento è stato calcolato come rapporto (campione IP per campione di input). Le coppie di primer sono elencate nella tabella 1 supplementare. Nessun segnale SYBR è stato rilevato nei controlli negativi, nelle cellule trattate con l’anticorpo fosfo-PKR IP e nelle cellule trattate con interferone-α + caliculina A con IgG di coniglio IP
Espressione e purificazione della proteina PKR
La PKR ricombinante è stata purificata come precedentemente riportato46. PKR pPET-PKR/PPase (Addgene #42934) è stata trasformata in cellule BL21(DE3) Rosetta (Novagen). Le cellule sono state coltivate in mezzo LB a 37 ° C fino A600 nm ~ 0,7 e l’espressione della proteina è stata indotta con 1 mM IPTG per 3 ore a ~ 20 ° C. Per la purificazione della PKR, le cellule sono state risospese nel buffer A (20 mM HEPES (pH 7.5), 50 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 10 mM β-mercaptoetanolo, 10% glicerolo) integrato con cocktail di inibitori di proteasi (Sigma). Le cellule sono state lisate mediante incubazione con 5 mg per ml di lisozima per 30 minuti seguita da sonicazione per 3 minuti. Il lisato è stato centrifugato per 20 min a 20.000g. Il surnatante è stato applicato ad una colonna di eparina Sepharose (Amersham, Biosciences, Piscataway, NJ) equilibrata nel buffer A e la PKR è stata eluita usando un gradiente di NaCl. Le frazioni di picco sono state diluite due volte con il buffer A e applicate a una colonna di agarosio poli (I:C) (Amersham) equilibrata nel buffer A. La PKR è stata eluita a 1,1 M NaCl, concentrata a ~10 mg per ml e conservata a -80 °C.
Saggio di attivazione PKR
I saggi di attivazione PKR sono stati eseguiti come precedentemente riportato47. PKR è stato defosforilato da λ-fosfatasi per 1 h a 30 °C e poi inibito con 2 mM orthovanadate di sodio. PKR (4 μM) è stato incubato con RNA lungo (NM_001136540.1, 289-1453: 0,75 μM: 269 ng per ml)/RNA corto (NM_001136540.1, 289-559/560-860/861-1179/1180-1453: 0.1 μM: 8.46 ng per ml)/poly (I:C) 20 μg per ml, 20 mM HEPES (pH 7.5), 4 mM MgCl2, 50 mM KCl, 1.5 mM DTT, e 100 μM ATP (Ambion). Le miscele di reazione sono state incubate a 30 ° C per i tempi indicati e spento con 1 × tampone di carico SDS. PKR fosforilati sono stati rilevati con fosfo-PKR anticorpo (Santa Cruz Biotechnology, sc-101784).
RNA preparazione per esperimenti di migrazione gel e SHAPE
RNA troncato APOL1 con varie cassette struttura 3′ sono stati preparati da trascrizione in vitro utilizzando il kit MegaShortScript (ThermoFisher) secondo le raccomandazioni dei produttori. Modelli di trascrizione sono stati generati in due reazioni di PCR semi-nested da plasmidi contenenti alleli APOL1 (G0, G1, G2) o varianti mutanti (mG0, mG1, mG2). Per la prima reazione, sono stati utilizzati primer forward e reverse per aggiungere un 5′ promotore T7 e un 45 nt 3′ SC, rispettivamente, alle sequenze APOL1 troncate (Tabella 1 supplementare). Quest’ultimo elemento è stato introdotto per fornire un sito di ibridazione di trascrizione inversa per SHAPE. Una frazione di ogni reazione è stato ri-amplificato utilizzando il primer avanti originale e un primer inverso più breve per rendere i modelli di trascrizione finale più omogeneo. Reazioni di trascrizione sono stati trattati con Turbo DNase I per 5 min a 37 ° C, incubato a 85 ° C per 2 min e frazionato su un gel denaturante (5% poliacrilammide-19:1, 1 × TBE, 7 M urea) a temperatura costante (45 ° C, 30 W max). I prodotti RNA desiderati sono stati rilevati da UV shadowing, escissi dal gel, elettroeluito a 200 V per 2 h a 4 ° C, etanolo precipitato e conservato a -20 ° C in 10 mM Tris, pH 7,0 prima dell’uso. Stock RNA soluzioni sono state quantificate mediante spettrofotometria.
Saggio di migrazione gel
Ogni troncato APOL1 RNA è stato diluito a 1 μM in 20 μL di tampone rinaturazione RNA (RB; 10 mM Tris (pH 8.0), 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 5% glicerolo (w per v)), denaturato da riscaldamento a 85 ° C per 2 min e rinaturato da raffreddamento lento (0,1 ° C per s) a 25 ° C. MgCl2 è stato poi aggiunto ad una concentrazione finale di 0, 1, o 3 mM e le miscele sono state incubate un ulteriore 30 min a 37 ° C per promuovere la formazione di Mg-dipendente e / o altre interazioni RNA terziarie. Conformi RNA sono stati stabilizzati dal raffreddamento rapido a 4 ° C, dopo di che sono stati frazionati su un 5% non denaturante gel di poliacrilamide (5% acrilammide, 19:1) per 16-18 ore a 4 ° C. Sia il gel che il buffer in esecuzione contenevano 1 × TBE e 1 mM MgCl2, e i gel sono stati pre-eseguiti per ~ 1 ora prima del caricamento. Gel sono stati esposti al colorante SybrGreen (ThermoFisher) secondo le istruzioni del produttore e le posizioni di migrazione dei conformatori RNA rilevato utilizzando un imager Typhoon Trio + modalità variabile (GE Healthcare).
SHAPE e generazione di modelli strutturali secondari RNA
SHAPE metodi sperimentali sono stati descritti in precedenza 48,49. Brevemente, il troncato APOL1 RNA con un SC RNA sono stati piegati come nel saggio di migrazione gel tranne che il volume della miscela era 150 μL, la concentrazione finale MgCl2 era 1 mM e glicerolo è stato escluso. Soluzioni di RNA sono stati divisi in controllo (1M7-) e sperimentale (1M7 +) aliquote (72 ml ciascuno), e 8 ml DMSO o 8 ml 30 mM 1M7 in DMSO è stato aggiunto, rispettivamente. Reazioni di modifica sono stati incubati a 37 ° C per 5 min, raffreddato a 4 ° C, etanolo precipitato e risospeso in 10 microlitri di acqua priva di nucleasi. RNA trattati sono stati trascritti inversamente da primer diversamente etichettati complementari alla cassetta struttura 3′ (1M7- primer, Cy5.5; 1M7 + primer, Cy5) e idrolizzato dal trattamento alcali. Le librerie di cDNA risultanti sono stati precipitati con etanolo e ri-dissolti in Sample Loading Solution (Genome Lab), poi raggruppati con ddA e ddG sequenziamento scale etichettati con WellRED D2 (Beckman Coulter) e IRDye 800RS (LI-COR), rispettivamente. I campioni combinati sono stati frazionati mediante elettroforesi capillare (CE) utilizzando un analizzatore genetico Beckman Coulter CEQ 8000. Per ogni RNA, profili di reattività sono stati generati da CE elettroferogrammi utilizzando SHAPEfinder software 50 e poi immessi in RNAstructure software versione 5.751,52 insieme con le sequenze di RNA per generare modelli strutturali secondari. Pendenza predefinito (1,8 kcal per mole) e intercetta (-0,6 kcal per mol) parametri sono stati utilizzati per trasformare i valori di reattività in pseudo-energia vincoli che modulano l’algoritmo di piegatura RNA. RNAstructure genera automaticamente più modelli strutturali che meglio corrispondono ai profili di reattività derivati da SHAPE e li classifica per energia libera di Gibbs. I modelli strutturali a più bassa energia prodotti in questo modo sono illustrati in Fig. 3a, b e nella Fig. 4 supplementare.
In vitro knock down
Abbiamo condotto esperimenti di knock down usando linee cellulari umane condizionatamente immortalizzate stabilite da urina umana42. Abbiamo trasfettato queste cellule con Stealth RNAi Negative Control Med GC (ThermoFisher) o con siRNA stealth predesigned contro APOL1 (HSS112492, ThermoFisher) utilizzando Lipofectamine RNAiMAX (ThermoFisher). BLOCK-iT™ Alexa Fluor Red Fluorescent Oligo è stato co-trasfettato e usato come controllo di trasfezione. Le efficienze di abbattimento sono state del 52,4-75,4% (livelli di RNA) o del 31,1% (livelli di proteine).
Mice
Abbiamo usato topi transgenici del gene APOL1 umano (topi BAC-APOL1), generati utilizzando un cromosoma artificiale batterico che contiene il locus per APLOL-G0, o APOL1-G1, o APOL1-G2. Un ~47 kb di DNA umano, che comprende solo il gene APOL1 con 5′ e 3′ regioni laterali (compresi gli esoni 1 e 2 di APOL2 e la regione 3′ compresi gli esoni 39-41 di parte del gene MYH9), è stato isolato e subclonato dal clone BAC umano (ENST00000397278, che corrisponde a NM_003661). I sottocloni BAC individuali G0, G1 e G2 sono stati iniettati in embrioni 129SvJ/B6N F1 e i fondatori sono stati successivamente reincrociati in 129SvJ. Il sottoclone è stato sequenziato per garantire che fosse come sequenza del genoma di riferimento da NCBI e Ensembl. Le uniche differenze erano polimorfismi nelle regioni introniche. Negli esperimenti sui topi transgenici condizionali, abbiamo usato topi transgenici con RNA troncato APOL1 specifici per il podocita e con background FVB. Abbiamo prodotto questi topi per mezzo di un sistema transgenico condizionato usando la sequenza di RNA troncato guidata da nefrina (NPHS1) (NM_001136540, 1031-1453). Abbiamo generato due ceppi: NPHS1-APOL1-G0-delta-RNA con rs73885319 A e rs60910145 G e NPHS1-APOL1-G1-delta-RNA con rs73885319 G e rs60910145 G.
Isolamento dei glomeruli
ai topi BAC/APOL1 (di età compresa tra 8 e 12 settimane) è stato somministrato IFNγ (106 U per kg di peso corporeo IP) ogni giorno per 3 giorni prima del campionamento dei tessuti. Il protocollo di isolamento glomerulare è stato riportato in dettaglio53. Brevemente, i topi sono stati anestetizzati da un’iniezione intraperitoneale di Avertin (2,2,2-tribromoetil e alcool amilico terziario; 17 μL per g) e perfuso con 8 × 107 Dynabeads (M450 tosylactivated: Dynal #140.04) diluito in 20 ml di fosfato-buffered salina attraverso il cuore. I reni sono stati digeriti con collagenasi A e DNase I a 37 °C per 10 minuti. Il tessuto digerito dalla collagenasi è stato premuto delicatamente attraverso un filtro cellulare da 100 μm e lavato con HBSS. I campioni sono stati lavati e risospesi utilizzando un supporto magnetico. I glomeruli sono stati raccolti e incubati in RPMI1640 integrato con 10% FBS, ITS, 1% penicillina/streptomicina (100 iU per ml; 100 μg per ml) e 100 mM calyculin A (LC Laboratories) per 30 min e utilizzati per l’analisi Western blot.
Immunoistochimica (campioni di topo)
A topi BAC/APOL1 (tra 8 e 12 settimane di età) sono stati somministrati IFNγ (106 U per kg di peso corporeo IP) ogni giorno per 3 giorni. I topi sono stati perfusi con 100 mM calyculin A contenuto PBS prima del campionamento dei tessuti. Poi i reni sono stati tagliati in piccoli pezzi e incubati in RPMI1640 integrato con 10% FBS, ITS, e 100 mM calyculin A per 30 min. Poi i tessuti sono stati immediatamente fissati con formalina tamponata al 10%. Ai topi BAC/APOL1 (di età compresa tra 8 e 12 settimane) è stato somministrato IFNγ (106 U per kg di peso corporeo IP) ogni giorno per 3 giorni. Ai topi NPHS1-APOL1-ΔRNA è stato somministrato IFNγ (106 U per kg di peso corporeo IP) ogni giorno per 3 giorni prima del campionamento dei tessuti. Abbiamo usato la paraffina fissata sezioni di tessuto 4-5 μm. Le sezioni sono state deparaffinate/reidratate, il recupero dell’antigene è stato eseguito riscaldando in mezzo tamponato con citrato per 5 minuti in un microonde. I tessuti sono stati bloccati da 1% BSA e 0,1% saponina. Le sezioni sono state incubate con anticorpi primari tra cui i seguenti: APOL1 (Sigma Aldrich HPA018885), fosfo-PKR (Santa Cruz Biotechnology sc-16565), fosfo-PKR (Santa Cruz Biotechnology Inc. sc-101784), WT1 (Santa Cruz Biotechnology sc-192), e podocalyxin (R&D Systems AF1556). Per l’immunofluorescenza, abbiamo usato anticorpi secondari Alexa Fluor (ThermoFisher) e visualizzati usando la microscopia confocale. Per la colorazione ABC, sono stati utilizzati anticorpi secondari coniugati con biotina e Avidina-HRP (Vector). Un kit DAB (Vector) è stato utilizzato per la visualizzazione. Negli esperimenti sui topi, i topi (di età compresa tra 8 e 12 settimane) sono stati trattati con IFNγ (106 U per kg di peso corporeo IP), iniettato per 3 giorni prima del campionamento dei tessuti. Per la quantificazione del segnale, fosfo-PKR segnale di podocita è stato rilevato da contro macchia per WT1 negli esperimenti del mouse.
Immunohistochemistry (campioni umani)
Questo studio è stato approvato in anticipo da IRB in Università del Maryland e del NIDDK, NIH. Le caratteristiche di base dei casi sono elencate nella Fig. 5b supplementare. La colorazione è stata eseguita utilizzando 5 μm di spessore fissato in formalina, sezioni di tessuto in paraffina. Dopo la deparaffinizzazione, il recupero dell’antigene indotto dal calore è stato eseguito per 20 min in un tampone di pH 6.0 utilizzando una pentola a pressione (Pascal, Agilent Technologies Dako). Le sezioni sono state incubate con anticorpi primari tra cui i seguenti: fosfo-PKR (Santa Cruz Biotechnology sc-16565) e WT-1 (Santa Cruz Biotechnology sc-192). Abbiamo usato anticorpi secondari Alexa Fluor (ThermoFisher) e visualizzato usando la microscopia confocale.
Immunoistochimica e live cell imaging
Le cellule sono state incubate con 200 nM di Mito Tracker Green (Invitrogen) e 200 nM di TMRE (Invitrogen) per 20 min prima della rilevazione del segnale, dopo il trattamento con 20 μM FCCP e visualizzate usando la microscopia confocale.
Quantificazione del segnale delle immagini microscopiche
Per il tessuto umano, abbiamo contato i glomeruli senza sclerosi globale (6 casi di genotipo non a rischio: 5, 6, 7, 10, 5, e 9 glomeruli per ogni caso, rispettivamente; 6 casi con genotipo a rischio: 13, 6, 4, 5, 10 e 5 glomeruli, rispettivamente). Per i tessuti del topo e dell’uomo, la potenza del laser è stata regolata in modo che il segnale massimo non fosse saturato. Elaborazione delle immagini e analisi di colocalizzazione sono stati eseguiti utilizzando il software Zen (Carl Zeiss, Oberkochen, Germania) 54. Coefficiente di colocalizzazione ponderato e intensità media in WT-1 cellule positive sono stati calcolati come precedentemente riportato 54. Per l’intensità media, abbiamo standardizzato l’intensità del segnale podocita utilizzando i segnali da WT1-negativi cellule intra-glomerulari per ogni glomerulo. I valori erano punteggio relativo con intensità del segnale di APOL1-G0 come 100%. Le quantificazioni sono state eseguite in modo cieco.
Ibridizzazione in situ
Il rilevamento cromogenico in situ è stato eseguito su sezioni di tessuto dal topo fissato in formalina paraffina-embedded (FFPE) blocchi utilizzando il RNAscope in situ hybridization (Advanced Cell Diagnostics, Biotechne, Minneapolis, MN). In breve, sezioni di tessuto FFPE 5 μm sono stati de-paraffinati, bollito con reagente pretrattamento per 15 min, e poi proteasi digerito a 40 ° C per 30 min, seguita da ibridazione per 2 ore a 40 ° C con sonda-Hs-APOL1-01 (Catalogo # 439871, Advanced Cell Diagnostics). Inoltre, Probe-Mm-PPIB (Catalogo # 313911) e Probe-DapB (Catalogo # 310043) sono stati utilizzati per il controllo positivo e negativo, rispettivamente. Rilevamento dei siti di legame sonda specifica è stata visualizzata con RNAScope 2.0 HD Reagent Kit (Brown) (Catalogo # 310035).
Mouse proteinuria modello
Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con il National Institutes of Health Guida per la cura e l’uso di animali da laboratorio e sono stati approvati in anticipo dal NIDDK Animal Care and Use Committee (proposta studio animale (K097-KDB-14)). Abbiamo usato topi maschi e femmine, di età compresa tra 8 e 15 settimane. I topi in ogni esperimento sono stati abbinati per sesso, età e peso corporeo. Le randomizzazioni sono state eseguite in relazione al peso corporeo. Dimensioni del campione per gli esperimenti sono stati determinati senza calcoli di potenza formale. I criteri di esclusione erano la perdita di peso superiore al 20% durante il periodo sperimentale. Per l’induzione di proteinuria, i topi (tra 8 e 12 settimane di età) sono stati iniettati con bFGF e puromicina aminonucleoside, come precedentemente descritto30. Per NPHS1-APOL1-deltaRNA ceppo di topi, puromicina aminonucleoside (Sigma-Aldrich) è stato iniettato per via sottocutanea al giorno 0 (200 mg per kg di peso corporeo), e bFGF (Kaken Pharmaceutical) è stato iniettato per via endovenosa ai giorni 0 e 2 (5 μg per animale), rispettivamente. Per gli esperimenti con l’inibitore PKR, l’inibitore PKR C16 (10 μg per kg IP) è stato iniettato quotidianamente dal giorno 0 al giorno 1055. Per il ceppo di topi BAC-APOL1, l’interferone γ (Prospec) è stato iniettato al giorno -1 e al giorno 1 (106 U per kg di peso corporeo), la puromicina aminonucleoside è stata iniettata per via sottocutanea al giorno 0 (300 mg per kg di peso corporeo), e bFGF (Kaken Pharmaceutical) è stato iniettato per via endovenosa ai giorni 0 e 2 (5 μg per animale), rispettivamente. Per gli esperimenti con l’inibitore PKR, l’inibitore PKR C16 (10 μg per kg IP) quotidianamente dal giorno 0 al giorno 1055.
Misurazione dell’albumina e della creatinina urinaria
Abbiamo determinato i livelli di albumina urinaria con ELISA usando un kit ELISA per microalbuminuria murina (Exocell). Abbiamo misurato la concentrazione di creatinina nelle urine con un kit per la creatinina (Exocell). Tutte le misurazioni sono state eseguite in duplicato. Abbiamo determinato l’albuminuria come rapporto tra albumina urinaria e creatinina. Tutte le procedure sono state eseguite in accordo con i protocolli dei produttori. Gli investigatori non erano ciechi all’assegnazione del gruppo, ma erano ciechi nella valutazione del risultato.
Analisi statistica
I dati di almeno tre esperimenti individuali sono stati analizzati e presentati come dot plot e media. I metodi di analisi statistica sono stati scritti nella legenda di ogni figura. Non abbiamo aggiustato per i confronti multipli. I valori di P < 0,05 sono stati considerati statisticamente significativi.