De effecten van temperatuur en relatieve vochtigheid op de levensvatbaarheid van het SARS-coronavirus

Abstract

De belangrijkste transmissieroute van SARS CoV-infectie wordt verondersteld via respiratoire druppeltjes te verlopen. Het virus is echter ook aantoonbaar in andere lichaamsvloeistoffen en uitscheidingsproducten. De stabiliteit van het virus bij verschillende temperaturen en relatieve vochtigheid op gladde oppervlakken werd bestudeerd. Het gedroogde virus op gladde oppervlakken bleef gedurende meer dan 5 dagen levensvatbaar bij temperaturen van 22-25°C en een relatieve vochtigheid van 40-50%, d.w.z. in typische airconditioned omgevingen. De levensvatbaarheid van het virus ging echter snel verloren (>3 log10) bij hogere temperaturen en een hogere relatieve vochtigheid (bv. 38°C en een relatieve vochtigheid van >95%). De betere stabiliteit van het SARS-coronavirus bij lage temperatuur en lage luchtvochtigheid kan de overdracht ervan vergemakkelijken in gemeenschappen in subtropisch gebied (zoals Hong Kong) tijdens de lente en in omgevingen met airconditioning. Het kan ook verklaren waarom sommige Aziatische landen in tropisch gebied (zoals Maleisië, Indonesië of Thailand) met een hoge temperatuur en een hoge relatieve vochtigheid geen grote uitbraken van SARS in de gemeenschap hebben gehad.

1. Inleiding

Severe acute respiratory syndrome (SARS), was een nieuwe opkomende ziekte geassocieerd met ernstige longontsteking en verspreidde zich over meer dan 30 landen in 5 continenten in 2003. Een nieuw coronavirus werd als de oorzaak geïdentificeerd. SARS had dramatische gevolgen voor de gezondheidszorg en de economieën van de getroffen landen, en het totale sterftecijfer werd op 9% geschat, maar liep op tot 50% bij mensen van 60 jaar en ouder. Een opmerkelijk kenmerk van deze ziekte was de voorliefde voor overdracht in de gezondheidszorg en op naaste familie- en sociale contacten. Aangenomen wordt dat de ziekte wordt verspreid via druppeltjes, direct of indirect nauw contact, maar het relatieve belang van deze overdrachtswegen is momenteel onduidelijk. Uit een studie is gebleken dat virale aërosolvorming bij een SARS-patiënt mogelijk was en dat druppeltransmissie via de lucht dus een mogelijke manier van overdracht was. De rol van fomites en milieucontaminatie bij de overdracht van de infectie is momenteel echter nog onduidelijk. Een uitbraak van de ziekte waarbij meer dan 300 bewoners van een hoogbouwflat (Amoy Gardens) in Hongkong werden getroffen, kon niet worden verklaard door de overdracht van ademhalingsdruppeltjes van besmette patiënten. Besmettelijk virus is aantoonbaar in de feces , en aerosolisatie van virus in besmette feces wordt verondersteld de wijze van overdracht van deze uitbraak te zijn .

Wij en anderen hebben gemeld dat de besmettelijkheid van SARS CoV (SARS coronavirus) verloren ging na verhitting bij 56°C gedurende 15 minuten, maar dat het stabiel was gedurende ten minste 2 dagen na drogen op plastic. Het werd volledig geïnactiveerd door de gebruikelijke fixeermiddelen die in het laboratorium worden gebruikt. Een andere studie toonde aan dat het geïnactiveerd werd door ultraviolet licht, alkalische (), of zure () omstandigheden. Er is aangetoond dat menselijke coronavirussen verscheidene dagen overleven in PBS of kweekmedium met 5-10% FCS, maar ze overleven slechts enkele uren na droging . Er zijn enkele studies geweest die een verband hebben gemeld tussen de SARS-uitbraak, metrologische factoren en luchtverontreiniging . Informatie over de overleving van het SARS-coronavirus (SCoV) in het milieu bij verschillende temperatuur- en vochtigheidsomstandigheden is dus van groot belang om de overdracht van het virus te begrijpen. In een recente studie waarbij gebruik werd gemaakt van surrogaat coronavirussen (overdraagbaar gastro-enteritisvirus (TGEV) en muizenhepatitisvirus (MHC)) werd het effect van de luchttemperatuur en de relatieve vochtigheid op de overleving van coronavirussen op het oppervlak onderzocht. De overlevingseffecten van deze omgevingsfactoren op het SARS-coronavirus blijven onduidelijk. In de huidige studie rapporteren wij de stabiliteit van het SARS coronavirus bij verschillende temperaturen en relatieve vochtigheid.

2. Materiaal en Methoden

2.1. Virusstam en cellijn

De in deze studie gebruikte SARS CoV-stam is HKU39849. Foetale apenniercellen (FRhK-4) werden gekweekt in minimaal essentieel medium (MEM, Gibco, USA) met 10% foetaal kalfsserum en penicilline streptomycine (Gibco, USA) bij 37°C in 5% CO2 en werden gebruikt voor het kweken van virusstammen en voor titratie van virale infectiviteit.

2.2. Voorbereiding van stockvirus

Stockvirus werd geoogst wanneer infectie ongeveer 75% van de celmonolaag van een met virus besmette kolf cytopathisch effect (CPE) manifesteerde. Geïnfecteerde cellen werden onderworpen aan één cyclus van vriezen en ontdooien en gedurende 20 minuten bij 2000 rpm gecentrifugeerd om celdébris te verwijderen; het supernatans van de kweek werd aliquoteerd en bij -80°C bewaard tot gebruik.

2.3. Determination of Tissue Culture Infectious Dose (50%) (TCID50)

96-well microtitre plates containing 100 μL confluent FRhK-4 were infected with 100 μL of serial 10-fold of dilutions of stock virus in minimal essential medium with 1% FCS (maintenance medium) starting from 10-1 to 108. Titraties werden uitgevoerd in viervoud. Geïnfecteerde cellen werden gedurende 4 dagen bij 37°C geïncubeerd. Het verschijnen van CPE werd dagelijks geregistreerd. TCID50 werd bepaald volgens de methode van Reed en Muench.

2.4. Effect van drogen, warmte en relatieve vochtigheid

Tien microliter onderhoudsmedium dat 107 TCID50 per ml virus bevatte, werd in afzonderlijke putjes van een plastic plaat met 24 putjes geplaatst en bij kamertemperatuur (22~25°C) en een relatieve vochtigheid van 40-50% (d.w.z. de omstandigheden in een typische kamer met airconditioning) laten drogen. Honderd microliter MM werd gebruikt om het virus te resuspenderen bij 0 uur, 3 uur, 7 uur, 11 uur, 13 uur, 24 uur, en tot 4 weken en de residuele virus infectiviteit werd getitreerd. Controles in gesloten eppendorf buisjes met schroefdop werden telkens opgenomen en op dezelfde manier behandeld, maar zonder drogen.

Het experiment werd herhaald bij verschillende temperaturen (38°C, 33°C, 28°C) en relatieve vochtigheden (>95%, 80~89%) gedurende 3 uur, 7 uur, 11 uur, 13 uur, en 24 uur. Een vernevelaar onder een gecontroleerde voorwaarde werd gebruikt om hoge en relatieve lage vochtigheid omgeving te genereren. Alle bovengenoemde experimenten werden in duplo uitgevoerd en de residuele virale infectiviteit werd getitreerd.

2.5. Infectivity Assay

De infectiviteit van restvirus werd in viervoud getitreerd op 96-well microtiterplaten met 100 μL confluente FRhK-4-cellen. 100 μl seriële 10-voudige verdunningen van het virus in onderhoudsmedium, gaande van 10-1 tot 108, werd aan FRhK-4-cellen toegevoegd. De geïnfecteerde cellen werden gedurende 4 dagen bij 37°C geïncubeerd. Het verschijnen van CPE werd dagelijks geregistreerd. TCID50 werd bepaald volgens de methode van Reed en Muench.

3. Resultaten

Tien microliter van 107 TCID50 per ml virus werd in afzonderlijke putjes van een plastic plaat met 24 putjes (die een niet-poreus oppervlak vertegenwoordigt) gebracht en gedroogd. Het gedroogde virus werd vervolgens bij verschillende temperaturen (38°C, 33°C, 28°C) en relatieve vochtigheid (>95%, 80~89%) gedurende 3 uur, 7 uur, 11 uur, 13 uur en 24 uur geïncubeerd en de residuele virale infectiviteit werd getitreerd. Een soortgelijk experiment werd uitgevoerd bij kamertemperatuur en relatieve vochtigheid van ongeveer 40-50% (kamer met airconditioning) gedurende maximaal 4 weken. Op plastic gedroogd virus behield gedurende 5 dagen bij 22~25°C en een relatieve vochtigheid van 40~50% zijn levensvatbaarheid met slechts verlies van titer (figuur 1). Daarna gaat de infectiviteit van het virus geleidelijk verloren. Het verlies van infectiviteit van het virus in oplossing was in het algemeen vergelijkbaar met gedroogd virus onder deze omgevingsomstandigheden. Dit wijst erop dat SARS CoV een stabiel virus is dat mogelijk kan worden overgedragen door indirect contact of fomites, vooral in omgevingen met airconditioning.

Figuur 1

Residuele virusinfectiviteit bij 22-25°C met een relatieve vochtigheid van 40-50% (starttiter 105/10 μL) en bij 33°C of 38°C met een relatieve vochtigheid van >95%.

Een hoge relatieve vochtigheid (>95%) bij relatief lage temperatuur (28°C en 33°C) had geen significante invloed op de virusinfectiviteit (figuur 2(a)). Hoge temperatuur (38°C) bij 80-90% relatieve vochtigheid leidde tot een titerverlies van 0,25~2 na 24 uur (figuur 2(b)). Wanneer het gedroogde virus echter bij hoge temperatuur (38°C) en hoge relatieve vochtigheid (>95%) werd bewaard, was er nog eens een titerverlies van ~1,5 voor elk tijdstip tot 24 uur (0,38~3,38 ) in vergelijking met hoge temperatuur (38°C) bij een lagere relatieve vochtigheid van 80-90% (figuren 3(a)-3(c)).

(a)

(b)

(a)
(b)

Figuur 2

Infectiviteit van SARS-coronavirus (105/10 μL) bij verschillende temperaturen bij (a) >95% relatieve vochtigheid, (b) >80-89%.

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Figuur 3

Infectiviteit van SARS-coronavirus (begintiter 105/10 μL) bij verschillende relatieve luchtvochtigheid bij (a) 38°C, (b) 33°C en c) 28°C.

4. Discussie

Virussen vermenigvuldigen zich niet buiten levende cellen, maar infectieus virus kan overleven op besmette oppervlakken in de omgeving en de duur van de persistentie van levensvatbaar virus wordt sterk beïnvloed door temperatuur en vochtigheid. Het is bekend dat besmette oppervlakken belangrijke vectoren zijn bij de overdracht van infecties in het ziekenhuis en in de gemeenschap. De rol van fomites bij de overdracht van RSV is duidelijk aangetoond. Overleving van virussen op een verscheidenheid van fomites is bestudeerd voor griepvirussen, paramyxovirussen, poxvirussen, en retrovirussen. Van het menselijke coronavirus dat in verband wordt gebracht met verkoudheid werd gemeld dat het slechts gedurende 3 uur na drogen levensvatbaar blijft op oppervlakken in de omgeving, hoewel het in vloeibare suspensie vele dagen levensvatbaar blijft. Parainfluenza- en RSV-virussen waren na droging op oppervlakken gedurende respectievelijk 2 en 6 uur levensvatbaar. In aërosolvorm is humaan coronavirus 229E over het algemeen minder stabiel bij een hoge luchtvochtigheid . De omgevingsstabiliteit van SCoV was voorheen onbekend en deze informatie is duidelijk van belang voor het begrijpen van de mechanismen van overdracht van dit virus in een ziekenhuis- en gemeenschapsomgeving.

In de huidige studie hebben we aangetoond dat SARS CoV ten minste twee weken kan overleven na het drogen bij temperatuur- en vochtigheidscondities zoals aangetroffen in een omgeving met airconditioning. Het virus is 3 weken stabiel bij kamertemperatuur in een vloeibare omgeving, maar het wordt gemakkelijk gedood door warmte bij 56°C gedurende 15 minuten . Dit wijst erop dat het SARS-CoV een stabiel virus is dat mogelijk door indirect contact of fomites kan worden overgedragen. Deze resultaten kunnen erop wijzen dat besmette oppervlakken een belangrijke rol kunnen spelen bij de overdracht van de infectie in het ziekenhuis en in de gemeenschap.

Uw studies geven aan dat SCoV relatief stabieler is dan de humane coronavirussen 229E of OC43 en sommige andere virale respiratoire pathogenen zoals respiratoir syncytieel virus. Deze bevindingen suggereren dat, hoewel directe druppeltransmissie een belangrijke transmissieroute is, de rol van fomites en omgevingscontaminatie bij de overdracht van het virus een belangrijke rol kan spelen. In het bijzonder kunnen fomites bijdragen tot de voortdurende overdracht van infectie in de nosocomiale omgeving die zich blijft voordoen ondanks de grote aandacht en de strenge voorzorgsmaatregelen die worden genomen om druppelverspreiding te voorkomen. Naast de voorzorgsmaatregelen tegen druppels is het nodig de voorzorgsmaatregelen tegen contact en het wassen van de handen te versterken.

Faecale besmetting van het SCoV coronavirus kan dus een effectieve route zijn voor de overdracht van de ziekte. De uitbraak in Amoy Garden in Hong Kong, waarbij meer dan 300 bewoners van een eengezinswoning werden getroffen, is vermoedelijk overgebracht door besmet rioolwater. De stabiliteit van het virus op oppervlakken in de omgeving en de aanwezigheid ervan in feces wijst erop dat fecale besmetting van de productie van vers voedsel een bedreiging kan vormen voor de overdracht van het virus; vooral in landen met slechte sanitaire voorzieningen en rioolstelsels en dat studies om deze mogelijkheid aan te pakken nodig zijn.

In deze studie toonden we aan dat een hoge temperatuur bij een hoge relatieve vochtigheid een synergistisch effect heeft op de inactivering van de levensvatbaarheid van SARS CoV, terwijl lagere temperaturen en een lage luchtvochtigheid een langdurige overleving van het virus op besmette oppervlakken ondersteunen. De milieuomstandigheden in landen als Maleisië, Indonesië en Thailand zijn dus niet bevorderlijk voor de langdurige overleving van het virus. In landen als Singapore en Hong Kong, waar intensief gebruik wordt gemaakt van airconditioning, vond de overdracht grotendeels plaats in goed geconditioneerde omgevingen zoals ziekenhuizen of hotels. Voorts is uit een afzonderlijke studie gebleken dat tijdens de epidemie het risico van een verhoogde dagelijkse incidentie van SARS 18,18-maal hoger was op dagen met een lagere luchttemperatuur dan op dagen met een hogere temperatuur in Hong Kong en andere regio’s . Tezamen kunnen deze waarnemingen verklaren waarom sommige Aziatische landen in tropisch gebied (met hoge temperatuur bij hoge relatieve luchtvochtigheid), zoals Maleisië, Indonesië en Thailand, geen nosocomiale uitbraken van SARS hebben gekend (tabellen 1 en 2(a)-2(c)). Dit kan ook verklaren waarom Singapore, dat ook in een tropisch gebied ligt (tabel 2(d)), de meeste SARS-uitbraken in ziekenhuizen had (omgeving met airconditioning). Interessant is dat de clinici tijdens de uitbraak van SARS in Guangzhou de ramen van de patiëntenkamers openhielden en goed ventileerden, waardoor de overleving van het virus wellicht is verminderd en er minder nosocomiale overdracht was. Het SARS-COV kan tot twee weken infectieus blijven bij een lage temperatuur en luchtvochtigheid, wat de virusoverdracht in de gemeenschap, zoals in Hongkong, dat in een subtropisch gebied ligt, zou kunnen vergemakkelijken (tabel 2 e)). Er moet ook rekening worden gehouden met andere milieufactoren, zoals windsnelheid, dagelijks zonlicht en luchtdruk, waarvan is aangetoond dat ze verband houden met de SARS-epidemie. Bij de dynamiek van de SARS-epidemie spelen meerdere factoren een rol, waaronder de fysieke eigenschappen van het virus, het milieu buiten en binnen, hygiëne, ruimte en genetische aanleg . Inzicht in de stabiliteit van virussen in verschillende temperatuur- en vochtigheidsomstandigheden is belangrijk voor het begrijpen van de overdracht van nieuwe infectieuze agentia, waaronder die van de recente influenza-apandemie H1N12009.