Pianta acquatica Azolla come materia prima universale per la produzione di biocarburante

Trattamento delle acque reflue sintetiche con Azolla filiculoides

Per l’esperimento di bioremediation, le acque reflue sintetiche ricche di selenio (SeSW) sono state preparate mescolando un’alta concentrazione di fosfati (PO4-P), 1.3 g/L con una moderata quantità di ammoniaca (NH4-N), 55 mg/L e una bassa concentrazione di nitrati (NO3-N), 15 mg/L (Additional file 4: Table S3). Questa composizione simula le caratteristiche degli effluenti delle tipiche industrie tessili di tintura, finissaggio e produzione di detersivi. Le acque reflue sono state integrate con 0,8 mg/L di SeO2. In questo esperimento, abbiamo usato un trattamento di 5 giorni di SeSW da parte di A. filiculoides. I tassi di crescita di alcune piante acquatiche che crescono su acque reflue normalmente aumentano esponenzialmente dopo una fase di ritardo osservata nei primi 4-5 giorni in cui la biomassa non cambia significativamente. Questo periodo, tuttavia, è associato con l’assorbimento intensivo dei nutrienti chiave dalle acque reflue, che porta alla forte crescita esponenziale delle piante acquatiche dopo la fase di ritardo. La rimozione dei nutrienti nel SeSW nei primi 5 giorni di trattamento da parte di A. filiculoides non ha portato a cambiamenti statisticamente significativi (P ≤ 0,05) nella produzione di biomassa (0,3 ± 0,1 g dw). Tuttavia, ha portato fino al 25,4% di assorbimento di NH4-N, 69,5% di assorbimento di NO3-N e 24,3% di assorbimento di PO4-P da 100 % SeSW (Tabella 1; Fig. 1). L’acqua di mare diluita (50 %) era meno stressante per l’A. filiculoides, come si riflette nei tassi più elevati di assorbimento dei nutrienti: 33,4, 93 e 39,8 % per NH4-N, NO3-N e PO4-P, rispettivamente. I tassi di assorbimento dei nutrienti da parte di A. filiculoides sono stati riportati in precedenza da diversi gruppi di ricerca.

Il trattamento di SeSW con A. filiculoides ha portato al 40% di assorbimento di Se dal 100 % SeSW e al 76% di assorbimento dal 50 % SeSW con tassi di assorbimento di 47.6 µg Se/L-day e 39.9 µg Se/L-day, rispettivamente (Fig. 2; Tabella 2). Questo è stato correlato con tassi di accumulo di 158,8 µg di Se/g dw-day in A. filiculoides dal 100 % SeSW e 133,5 µg di Se/g dw-day dal 50 % SeSW (Tabella 2). Questa efficienza di assorbimento rappresenta l’85 e l’83% del valore di assorbimento massimo teorico per 50 % SeSW e 100 % SeSW, rispettivamente. Un tasso di assorbimento di Se approssimativamente simile è stato mostrato da un altro rappresentante dell’Azolla, Azolla caroliniana, che ha assorbito fino a 1 mg Se/g dw da una soluzione di 2,5 mg/L Se durante 2 settimane di trattamento. Questo è superiore a quello di altre piante acquatiche, Salvinia rotundifolia (0,7 mg Se/g dw), Lemna minor (500 mg Se/g dw) e Eichhornia (300 mg Se/g dw).

Il tasso di sopravvivenza di P. australiensis esposto a diluizioni di SeSW è mostrato nel file aggiuntivo 5: Figura S2. La sopravvivenza è stata nulla (0 %) quando sono stati esposti per 96 ore al 100 % di SeSW non trattata (controllo). Nessun gambero vivo è stato osservato anche in 80 % o 50 % SeSW. Dopo il trattamento con A. filiculoides, la tossicità della SeSW è stata ridotta di 2,6 volte con LC50 aumentata da 11,22 a 29,80 %. Questo indica che quando il 100% di SeSW è stato trattato con A. filiculoides, la sua tossicità è stata significativamente ridotta dopo soli 5 giorni di trattamento.

Produzione di biocarburante da Azolla

Analisi approssimative e proximate di Azolla filiculoides

I risultati delle analisi approssimative e finali del campione di A. filiculoides, compreso il contenuto totale di volatili, umidità, carbonio fisso e ceneri (cioè i componenti inorganici dei campioni), sono riassunti nel file aggiuntivo 6: Tabella S4. I volatili totali raccolti a 950 °C rappresentano l’88% del prodotto totale. Il prodotto totale aveva 11% di umidità, 7,3% di ceneri e 4,4% di carbonio fisso. L’analisi proxima ha mostrato che gli elementi chiave comprendono 46,2 % C, 7,4 % H, 3,0 % N, 43,2 % O e 0,2 % S (calcolato per differenza).

Analisi termogravimetrica di Azolla filiculoides

L’analisi TGA-DTG del campione di A. filiculoides è stata effettuata ad un intervallo di temperatura di 23-900 °C con una velocità di riscaldamento di 10 °C/min sotto un’atmosfera di azoto ed è mostrato in Fig. 3. Le curve TGA e DTG hanno rivelato le tre fasi di decomposizione dell’A. filiculoides nel processo di pirolisi; risultati simili sono stati riportati da Agrawal e Chakraborty . La biomassa ha subito tre fasi di perdita di peso, una tra 154 e 160 °C, la seconda tra 180 e 580 °C e la terza tra 580 e 900 °C circa. La prima zona rappresenta una leggera perdita di peso (7%) causata dalla disidratazione del campione di biomassa. La maggior parte della perdita di peso (51%) dovuta alla pirolisi ha avuto luogo nella seconda zona, dove viene rilasciata la maggior parte dei volatili; il forte picco denota la decomposizione di proteine, carboidrati e lipidi. Nella terza zona, c’è la decomposizione del prodotto carbonaceo, e quindi la perdita di peso è dovuta principalmente alla gassificazione dove i composti di carbonio altamente non volatili vaporizzano formando CO e CO2 a causa delle alte temperature .

Liquefazione idrotermale di Azolla filiculoides

La liquefazione idrotermale di A. filiculoides è stata eseguita utilizzando acqua distillata come solvente a 260, 280 e 300 °C con tempi di residenza di 15 minuti. Le condizioni di reazione sono state selezionate sulla base dei nostri studi precedenti e della letteratura per capire l’effetto della temperatura sulla resa del prodotto bio-olio di A. filiculoides sotto acqua subcritica. La distribuzione del prodotto del campione di A. filiculoides trattato con HTL è presentata in Fig. 4. Le rese totali di bio-olio erano 15,83, 21,50 e 16,0 % a 260, 280 e 300 °C, rispettivamente; quindi la resa massima è stata ottenuta a 280 °C. Il biopetrolio totale era composto dalla frazione di etere (Bio-oil1) ottenuta dall’estrazione della parte liquida, e dalla frazione di acetone (Bio-oil2) ottenuta dall’estrazione della frazione solida (sezione “Metodi”). Il Bio-oil2 aveva un’alta viscosità e si è visto che era un liquido catramoso. Le rese del residuo solido sono diminuite continuamente dal 66,83 al 33,83 % con l’aumento della temperatura da 260 a 300 °C. La resa dei gas è diminuita nel passaggio da 260 a 280 °C. Quando la temperatura era superiore a 280 °C, la resa dei gas aumentava al 7,1%. HTL della biomassa di A. filiculoides ha mostrato una distribuzione simile dei due prodotti principali, biogas e bio-char, con i dati ottenuti dopo la pirolisi con una media di biogas del 6,05 e 12% per HTL e pirolisi, rispettivamente, e bio-char intorno al 50% per entrambi. HTL ha generato un livello più alto di bio-olio, fino al 21,5% (14% per la pirolisi). Risultati simili sono stati ottenuti se confrontati con le rese di bio-olio ottenute sia dalla pirolisi che dalla HTL di microalghe.

In aggiunta ai dati di bilancio dei materiali, è stata studiata la conversione sulla base del carbonio organico totale (TOC) ottenuto dopo la liquefazione idrotermale a diverse temperature, e i risultati sono presentati nel file aggiuntivo 7: Tabella S5. C’era il 46,9% di carbonio organico nell’alimentazione che si traduce in 2,8 g di carbonio organico nei 6 g del campione usato per la liquefazione idrotermale. La conversione del carbonio organico è aumentata dal 13,93 al 48,93% con l’aumento della temperatura da 260 a 300 °C. I risultati hanno indicato che ad una temperatura più bassa, la decomposizione della biomassa era incompleta e lasciava una grande quantità di biomassa non reagita che può sopprimere la formazione di bio-olio. L’aumento della temperatura è stato in grado di accelerare la decomposizione della materia prima e ha favorito la formazione di bio-olio; tuttavia, un ulteriore aumento della temperatura, superiore a 280 °C nei nostri esperimenti, avrebbe scisso il bio-olio/intermedi precedentemente formato in gas e prodotti solubili in acqua e quindi ha portato a una diminuzione della resa in bio-olio. La riduzione della resa del residuo solido (bio-char) ha suggerito un aumento della conversione complessiva della biomassa quando la temperatura è stata aumentata da 260 a 300 °C.

Spettroscopia all’infrarosso con trasformata di Fourier del bio-olio

SpettriFT-IR del mangime A. filiculoides e del bio-olio1 ottenuto da HTL a 260, 280 e 300 °C sono mostrati nelle Figg. 5A e B. L’ampia banda intorno a 3200-3405 cm-1 è attribuita alla vibrazione di stiramento O-H o N-H causata da acqua o gruppi O-H o gruppi N-H presenti nel bio-olio (Fig. 5B). Un’ampia assorbanza è stata visualizzata intorno a 3314 cm-1 per la materia prima, che indica un alto contenuto di carboidrati e proteine (Fig. 5A).

I bio-oli hanno mostrato un assorbimento più debole a 3200-3405 cm-1, suggerendo che sia i carboidrati che le proteine sono stati decomposti nel processo HTL (Fig. 5B). Le bande da 2854 a 2950 cm-1 erano più forti per tutti i bio-oli a causa delle vibrazioni di stiramento C-H, indicando la presenza di gruppi alchilici C-H. La vibrazione di stiramento C=O intorno a 1645-1720 cm-1 nei bio-oli indica la presenza di chetoni, aldeidi, esteri o acidi. Le bande di vibrazione flettente intorno a 1580-1650 cm-1 indicano la presenza dei gruppi N-H delle ammine. Le bande nella regione da 1430 a 1480 cm-1 sono state attribuite alle vibrazioni flettenti α-CH2 presenti nei bio-oli. La presenza di bande di stretching C-N intorno a 1266-1342 cm-1 nei bio-oli è dovuta a gruppi amminici aromatici. Inoltre, alcuni altri picchi di assorbimento che appaiono a 780-850 cm-1 sono attribuiti alle vibrazioni di flessione C-H fuori piano degli aromatici. La banda a 1040 cm-1 è apparsa solo nel profilo di assorbimento del mangime di A. filiculoides, e potrebbe essere C-O collegata a gruppi idrossilici che sono stati disidratati dopo la liquefazione. Nel complesso, gli spettri dei campioni di bio-olio1 di HTL alle diverse temperature mostrano gli stessi picchi, indicando la presenza degli stessi gruppi funzionali, ed erano i vari picchi ottenuti negli spettri NMR.

Analisi NMR del bio-olio

L’analisi NMR dei campioni di bio-olio1 è stata intrapresa per capire i rapporti degli ambienti chimici dei protoni. Gli spettri NMR hanno fornito informazioni complementari sui gruppi funzionali agli spettri FTIR e la possibilità di quantificare e confrontare le aree di integrazione tra gli spettri. Simile al FT-IR, gli spettri 1H NMR hanno mostrato un’alta percentuale di gruppi funzionali alifatici per tutti i bio-oli, e un riassunto delle regioni di area di picco integrate assegnate alle diverse classi di gruppi funzionali è fornito in Fig. 6. La regione di campo più in alto degli spettri, da 0,5 a 1,5 ppm, rappresenta protoni alifatici attaccati ad atomi di carbonio ad almeno due legami da un C=C o eteroatomo (O o N). La successiva regione integrale da 1,5 a 3,0 ppm rappresenta protoni su atomi di carbonio alifatici che possono essere legati a un doppio legame C=C. Tutti i bio-oli avevano una percentuale più alta di protoni nella regione spettrale da 0,5 a 3,0 ppm. Avevano una percentuale più alta (63,15-71,76%) di protoni nella regione da 0,5 a 1,5 rispetto alla regione da 1,5 a 3,0 (18,73-28,8%), il che è probabilmente dovuto al gran numero di composti azotati e ossigenati che hanno dimostrato di risuonare in questa zona e che possono derivare dall’alto contenuto proteico della materia prima.

La porzione successiva dello spettro 1H NMR a 3,0-4,5 ppm rappresenta protoni metossilici o un gruppo metilico che unisce due anelli aromatici; in questa regione sono state osservate percentuali di protoni molto basse. Tutti i bio-oli hanno mostrato una bassa percentuale di funzionalità metossi/carboidrati (4,5-6,0 ppm). In questa regione, i valori massimi di percentuale protonica dei bio-oli erano 4,33 e 4,32% per le liquefazioni a 260 e 280 °C, il valore nettamente inferiore di 0,94% per la liquefazione a 300 °C. La regione dello spettro tra 6,0 e 8,5 ppm corrisponde alla regione aromatica. Il contenuto massimo di protoni di circa il 7,2% in questa regione è stato ottenuto per il bio-olio prodotto a 300 °C. La funzionalità aromatica/eteroaromatica è stata osservata in tutti i bio-oli (6,0-8,5 ppm) in accordo con i risultati della spettroscopia FT-IR. Le regioni dello spettro in basso (8,5-10 ppm) derivano dalle aldeidi. La funzionalità aldeidica (9.5-10.0 ppm) era assente da tutti i bio-oli nonostante i gruppi funzionali C=O (1645-1720 cm-1) osservati dalla FT-IR. La comparsa di tali bande FT-IR può anche essere dovuta ad altri gruppi carbonilici come acidi carbossilici protonati, esteri di acido carbossilico, ammidi e chetoni.

L’analisi GC-MS del bio-olio

GC-MS è stata utilizzata per comprendere ulteriormente la composizione del prodotto liquido e per confermare i risultati delle analisi FT-IR e NMR. La GC-MS ha mostrato chiaramente che la temperatura di liquefazione ha influenzato i componenti del bio-olio1. L’identificazione dei picchi principali dei composti è stata eseguita utilizzando il database degli spettri di massa del NIST. Gli esperimenti HTL hanno prodotto bio-oli derivanti dalla decomposizione di lignina, proteine, flavonoidi e lipidi insieme a una serie di composti derivati dai carboidrati. I componenti dei bio-oli sono stati identificati come composti aromatici mono- e policiclici, chetoni, aldeidi, esteri, alcoli, ammidi e altri composti contenenti azoto (compresi ammidi e composti N-eterociclici) e idrocarburi. Un’analisi semi-quantitativa è stata eseguita calcolando la percentuale relativa dell’area dei picchi cromatografici con i risultati riportati nella tabella 3. I principali composti osservati dalla liquefazione idrotermale di A. filiculoides erano metil pirazina, 2-metil 2-cyclopenten-1-one, fenolo, 2-metossi fenolo, 3-piridinolo, catecolo, l-prolina, N-butossi carbonil-butil estere, Bis(2-etilesil) ftalato e beta-sitosterolo. Poiché la temperatura di liquefazione idrotermale variava da 260 a 300 °C, c’è stata la produzione di diversi composti così come diverse proporzioni di composti. La percentuale d’area dei composti fenolici come il fenolo (6,1-18,8 % d’area) e il catecolo (10,0-15,7 % d’area) aumentava all’aumentare della temperatura da 260 a 280 °C, ma poi diminuiva all’11,1 % d’area per il fenolo e all’11,8 % d’area per il catecolo per 300 °C. I fenoli nel bio-olio di A. filiculoides sono stati probabilmente prodotti dalla parte di lignina o carboidrati della biomassa. I composti azotati sono formati da reazioni di decarbossilazione, deaminazione, disidratazione, depolimerizzazione e decomposizione delle proteine. La più alta area percentuale di 3-pirindiolo (13,3 area %) è stata osservata alla temperatura più bassa di 260 °C ed è diminuita a 11,9 e 10,1 area % per 280 e 300 °C, rispettivamente. Inoltre, è stata osservata l’area più alta circa (13,6, 12,4 e 8,7 area %) a 260, 280 e 300 °C. Poiché la composizione del prodotto liquido è così complessa, sarebbe necessario un ulteriore miglioramento, come la denitrogenazione e la deossigenazione, per rendere il bio-olio adatto ai carburanti per motori.

La composizione delle molecole ottenute nel bio-olio da HTL è stata confrontata con lo spettro delle molecole identificate nel bio-olio generato per pirolisi. A differenza dell’HTL, la pirolisi è la decomposizione termochimica della materia organica secca con un contenuto di umidità inferiore al 10% della frazione di massa in assenza di ossigeno, a pressione atmosferica e a temperature più elevate (350-550 °C). Entrambe le tecnologie termochimiche hanno mostrato un grande potenziale per convertire l’intera biomassa di Azolla in bio-oli che hanno densità energetiche più elevate rispetto alla materia prima iniziale della biomassa. I bio-oli da entrambe le reazioni termochimiche hanno una composizione molto complessa come risultato della depolimerizzazione e decomposizione dei monomeri della biomassa per scissione, disidratazione, decarbossilazione e deaminazione. I composti derivati dalle proteine erano rappresentati da fenoli, alchilfenoli, pirrolidinone, indolo e nitrile come risultato della decomposizione degli aminoacidi tirosina e fenilalanina trovati in Azolla. I prodotti derivati dai lipidi includevano una gamma di alcani saturi a catena lunga e acidi grassi di dimensioni da C12 a C21: dodecano, tridecano, tetradecano, pentadecano, esadecano, eptadecano, ottadecano, nonadecano, eicosano ed eneicosano. Una miscela simile di alcani a catena lunga derivati dai lipidi prodotti dalla pirolisi dei bio-liquidi è stata trovata nelle alghe. La differenza principale era che la pirolisi di A. filiculoides mostrava l’accumulo di fitolo, 3,7,11,15-tetrametil-2-esadecen-1-olo, alcol diterpenico aciclico, come il prodotto della degradazione della clorofilla era il prodotto di pirolisi più abbondante.

Analisi dei prodotti bio-residui

La figura 7 mostra gli spettri FT-IR del mangime Azolla e i bio-residui. Le ampie bande a 3200-3405 cm-1 sono assegnate alle vibrazioni di stiramento dei gruppi O-H e N-H legati a idrogeno e indicano la presenza di polisaccaridi, carboidrati e proteine presenti nel mangime di Azolla. I mangimi iniziali di Azolla hanno forti picchi di vibrazioni di stretching corrispondenti ai gruppi O-H e N-H, ma tale trasmittanza diminuisce nel bio-residuo. Il picco a 1030 cm-1 è scomparso nel bio-residuo. Il picco intorno a 1600-1620 cm-1 corrispondente alla vibrazione di flessione N-H era presente nel mangime di Azolla e nel bio-residuo di Azolla. I picchi tra 2800 e 2930 cm-1 negli spettri dei residui sono diventati molto più deboli di quelli del mangime grezzo di Azolla. La presenza di un singolo picco a 1590 cm-1, attribuito allo stretching C=C, indica la formazione di bio-car aromatici.

Gli spettri di diffrazione a raggi X (XRD) del mangime e dei bio-residui di A. filiculoides a diverse temperature non hanno mostrato differenze significative nel diffrattogramma a raggi X della polvere (file aggiuntivo 8: Figura S3). L’alimentazione della biomassa e i residui ottenuti a varie temperature hanno mostrato la tipica natura amorfa che indica che la struttura del carbonio nel residuo è costituita da fogli aromatici altamente coniugati e reticolati in modo casuale. I cambiamenti morfologici erano evidenti nelle immagini al microscopio elettronico a scansione (SEM) dell’Azolla e del bio-residuo (file aggiuntivo 9: Figura S4). Le immagini del bio-residuo ottenuto dalla liquefazione idrotermale dei tre bio-car di Azolla hanno mostrato che il residuo era di natura spugnosa, e non c’era una struttura porosa ordinata.

Produzione di idrogeno da biomassa di Azolla trattata con acido da Enterobacter cloacae DT-1

Sotto il pretrattamento calore-H2SO4, la biomassa di A. filiculoides è stata idrolizzata a diversi zuccheri ridotti solubili che consistono principalmente di glucosio (1,18 g/L), xilosio (1,39 g/L) e arabinosio (0,063 g/L). Il pre-idrolisato trattato con acido è stato usato come materia prima per la produzione di idrogeno da parte di Enterobacter cloacae (E. cloacae) in modalità batch sotto una pressione parziale ridotta pH2. Il pH2 influenza significativamente l’efficienza della produzione di idrogeno fermentativo da parte di batteri anaerobi, poiché le vie di produzione di idrogeno sono sensibili alla concentrazione di idrogeno che porta all’inibizione del prodotto finale. È stato riportato che un’alta pressione parziale di idrogeno porta alla produzione di più prodotti ridotti come etanolo e lattato invece di acetato, butirrato e H2. Il fermentatore batch è stato organizzato per esercitare una pressione sullo spazio di testa del fermentatore che ha permesso al biogas di uscire dallo spazio di testa subito dopo la sua generazione, riducendo così la pressione parziale totale e quindi la pressione parziale di idrogeno del fermentatore batch.

La fermentazione con E. cloacae DT-1 ha portato alla produzione di 53 mmol/L di idrogeno (Tabella 4). Durante la produzione di idrogeno fermentativo, il pH finale del brodo di fermentazione è sceso da 7,5 a 5,42, che può essere attribuito alla produzione di acidi grassi organici a catena corta. La produzione totale di acidi grassi volatili è stata di 1150 mg/L, in gran parte composta da acido acetico (986 mg/L) e acido butirrico (161 mg/L), con un rapporto B/A di 0,165. Quindi il ceppo DT-1 ha seguito il percorso acido misto e ha utilizzato efficacemente gli zuccheri C5 (xilosio, arabinosio e glucosio) dal preidrolisato trattato con acido. L’efficienza della produzione di idrogeno è stata di 2,43 mol di H2/mol di zucchero riducente. Poiché la massima efficienza teorica di produzione di idrogeno dalla via della fermentazione al buio è di 4 mol di H2/mol di glucosio, circa il 60% della massima produzione di idrogeno possibile è stato ottenuto dal preidrolisato di biomassa trattato con acido. Per quanto ne sappiamo, questo è il primo rapporto sulla produzione di idrogeno dagli zuccheri della biomassa di A. filiculoides.

Produzione di idrogeno dalla biomassa di Azolla trattata enzimaticamente da E. cloacae DT-1

L’idrolisi enzimatica della biomassa di A. filiculoides trattata con acido ha rilasciato glucosio e xilosio ad una concentrazione di 1,49 e 0,181 g/L, rispettivamente. Circa 34,8 mmol/L di produzione volumetrica di idrogeno (sotto pH2 diminuito) è stata ottenuta dagli zuccheri della biomassa idrolizzati enzimaticamente. Il pH finale del brodo di fermentazione è sceso a 5 durante la produzione di idrogeno che è stata accompagnata dalla produzione di acido acetico (990 mg/L) e acido butirrico (164 mg/L). La concentrazione totale di VFA era di 1156 mg/L e il rapporto B/A era di 0,165 (tabella 4). Questi risultati mostrano che è stato seguito il percorso di fermentazione acido misto. L’efficienza di produzione di idrogeno era di 2,04 mol di H2/mol di zucchero riducente; quindi, era inferiore a quella ottenuta dal preidrolisato trattato con acido. Nel complesso, l’efficienza di produzione di idrogeno del ceppo DT-1 dalla biomassa di Azolla filiculoides era di 2,2 ± 2 mol/mol di zucchero riducente. L’efficienza della produzione di idrogeno da Azolla è simile a quella ottenuta per le materie prime lignocellulosiche terrestri che copre l’intervallo di 044-2,76 mol H2/mol di zuccheri (file aggiuntivo 1: Tabella S1, file aggiuntivo 10: Tabella S6).

Il rapporto carbonio-azoto (C/N) della biomassa è importante per un’efficiente digestione anaerobica poiché i microrganismi richiedono molto più C che N (C:N di 25:1) per una produzione ottimale di idrogeno. Per questo motivo, l’applicazione delle microalghe per la produzione di idrogeno è limitata perché sono ricche di proteine e hanno un basso rapporto C/N (av. di 4) . La co-fermentazione con macroalghe (come Laminaria digitata), che sono ricche di carboidrati con un alto rapporto (C/N), migliora le prestazioni della produzione di idrogeno. A. filiculoides contiene il 41% di carboidrati totali e il 20% di proteine, di conseguenza l’analisi prossimale della biomassa ha mostrato un C/N di 15 (file aggiuntivo 6: tabella S4) che è vicino ad essere una materia prima efficiente per la produzione di bio-idrogeno.

Produzione di etanolo da Azolla filiculoides e A. pinnata

L’analisi chimica delle biomasse di A. filiculoides e A. pinnata è riportata nel file aggiuntivo 3: tabella S2. A. filiculoides ha mostrato un’alta concentrazione di biomolecole che possono essere utilizzate come materia prima per la produzione di bio-etanolo: amido (6,05%), cellulosa (21,8%) ed emicellulosa (13,5%). Ha il 10,3 % di lignina, che è superiore a quella di anatra e altre piante acquatiche, ma inferiore a quella delle principali colture bioenergetiche lignocellulosiche (file aggiuntivo 1: tabella S1). L’analisi chimica di A. pinnata ha mostrato una minore concentrazione di molecole che producono bio-etanolo: amido (4,7%), cellulosa (12,8%) ed emicellulosa (10,1%) e un più alto contenuto di lignina (fino al 13,2%).

La componente amido di A. filiculoides e A. pinnata è stata idrolizzata enzimaticamente da α-amilasi e α-amiloglucosidasi, e le componenti cellulosa/emicellulosa sono state idrolizzate da cellulasi e cellobiasi. Le quantità di glucosio rilasciate sono mostrate nella tabella 5. Come previsto, la combinazione di quattro enzimi che idrolizza la biomassa di A. filiculoides ha prodotto una maggiore quantità di glucosio rispetto a quella di A. pinnata (fino a 65,9 e 29,5 g/L, rispettivamente). Questa resa di glucosio era molto più alta rispetto al trattamento della biomassa di A. filiculoides con una sospensione di Aspergillus niger vivo coltivato su brodo di destrosio di patate (2,5 g/L di glucosio) mostrato da Pandey et al.

Dopo la fermentazione degli zuccheri ridotti con Saccharomyces cerevisiae le rese in etanolo, YE/G (etanolo/glucosio, g/g) riflettono la quantità di glucosio rilasciato nei campioni, con rese di 0,56 g/g osservate per A. filiculoides e 0,28 g/g per A. pinnata. Il rendimento di 0,56 g/g è paragonabile a quelli riportati dalla fermentazione di idrolizzati di alghe d’anatra e di alcune colture energetiche (file aggiuntivo 1: tabella S1). È interessante notare che l’integrazione della fermentazione con nutrienti aggiuntivi non ha mostrato un miglioramento significativo della resa in etanolo (non mostrato). Questo può essere spiegato dalla presenza dei nutrienti chiave per la crescita del lievito nella biomassa di entrambe le specie di Azolla.

La resa in etanolo basata sulla biomassa di A. filiculoides (YE/B) è stata determinata come 0,09 g/g che è simile alla resa di S. cerevisiae ATCC 24859 cresciuta sull’anatroccolo L. minor che contiene in media il 10% di amido. Una resa di etanolo più alta, 0,19 g/g, è stata osservata per il ceppo 6000 di Lemna aequinoctialis che ha un tasso di crescita veloce e la capacità di accumulare alti livelli di amido (fino al 39%). Il potenziale di un altro rappresentante delle anatre, Spirodela polyrrhiza, di aumentare il suo livello di amido in condizioni di stress fino al 45,7% insieme all’idrolisi enzimatica con α-amilasi, pullulanasi e α-amiloglucosidasi ha portato a YE/B di 0,28 g/g . La composizione chimica delle pareti cellulari e il minore accumulo di amido è stata la probabile ragione della minore resa in etanolo dalla biomassa di A. pinnata (YE/B = 0,05 g/g). L’utilizzo di diversi ceppi di lievito che possono fermentare meglio lo spettro di zuccheri rilasciati e sono più tolleranti ai potenziali inibitori, sarà il prossimo passo nell’ottimizzazione della resa di etanolo dalla biomassa di Azolla.

Azolla come materia prima universale per la produzione di biocarburanti

Un’analisi sistematica delle piante terrestri per il loro potenziale di essere colture bioenergetiche ideali ha portato a una serie di importanti criteri di selezione che includono: (1) composizione chimica e alta proporzione di molecole che producono biocarburanti; (2) alti tassi di crescita/produzione di biomassa; (3) alto indice di raccolto/periodo di rotazione; (4) capacità di crescere su terreni marginali e mancanza di competizione con le colture agricole per i terreni coltivabili; (5) alta efficienza nell’uso dell’acqua dolce e basso costo di crescita; (6) basso costo di raccolta; e (7) produzione di coprodotti di alto valore. Questi criteri hanno innescato un’intensa ricerca per l’addomesticamento della prossima generazione di colture energetiche.

Le specie di Azolla insieme al loro simbionte cianobatterico evolutivo, A. azollae, hanno attirato l’attenzione a causa del loro potenziale di affrontare tutti i criteri sopra menzionati. In primo luogo, la biomassa di Azolla contiene i principali tipi di molecole energetiche che includono cellulosa/emicellulosa, amido e lipidi che assomigliano alle combinazioni di colture bioenergetiche terrestri lignocellulosiche, amido e olio e microalghe/cianobatteri. In secondo luogo, raddoppiando la loro biomassa ogni 5-6 giorni e l’alta produttività annuale, sono una delle piante a crescita più rapida, essendo seconde dopo le microalghe per tassi di produzione di biomassa. Come le microalghe, la loro produzione di biomassa non è stagionale. In terzo luogo, l’Azolla può essere coltivata in modo efficiente al di fuori del suo habitat naturale usando l’acqua di scarico come principale fonte di nutrimento. Il biorisanamento delle acque reflue può portare all’assorbimento di fino a 2,6 e 0,434 t/ha-anno di N e P totali, rispettivamente. L’azolla può anche crescere efficientemente in mezzi impoveriti di N assimilando fino a 0,4 t di azoto N/ha-anno dall’atmosfera attraverso la simbiosi con A. azollae. In quarto luogo, sono facili da raccogliere. Infine, le specie di Azolla sono state usate per decenni come biofertilizzanti azotati e mangimi per il bestiame/pesce (a causa dei loro alti livelli di proteine e carboidrati). La mancanza di necessità di usare fertilizzanti sintetici a base di azoto per la coltivazione dell’Azolla ha un impatto positivo sostanziale sulla riduzione della generazione di ossido nitroso (N2O), il cui impatto sul riscaldamento dell’atmosfera è quasi 300 volte quello dell’anidride carbonica.

Tecnologie termochimiche

La biomassa di Azolla è stata usata come materia prima per la produzione di bio-olio, bio-char e biogas usando due tecnologie termochimiche, pirolisi e HTL (questo lavoro). Data l’alta produttività annuale di Azolla, questo porta alla produzione teorica di bio-oli a base di pirolisi e HTL valutati rispettivamente fino a 13,2 e 20,2 t/ha-anno. Entrambi i bio-oli contengono una gamma di prodotti petrolchimici che possono essere utilizzati direttamente come componenti senza glicerina del biodiesel o possono essere trasformati in biocarburanti utilizzando alcune tecnologie consolidate. Entrambe le tecnologie termochimiche possono anche produrre bio-solidi, come il bio-char e la cenere (fino a 48 t/ha-anno per entrambi), che possono essere utilizzati per migliorare la qualità del suolo aumentandone la capacità di trattenere i nutrienti e l’umidità, sostenere le comunità microbiche e promuovere l’attività delle radici. La cenere di Azolla contiene elementi alcalini (Li, Na, K, Mg, Ca) e microelementi come Fe, Mn e Cu che la rendono un buon candidato per l’uso come fertilizzante.

Produzione di biodiesel

Crescendo su acque reflue, il rendimento teorico annuale di lipidi grezzi da A. filiculoides può essere stimato come 1,68 t/ha-anno. Questa quantità può essere aumentata a 8 t/ha-anno se la pianta crescerà in condizioni naturali con una produttività di circa 100 t dw/ha-anno. Questa produttività di olio è significativamente superiore a quella della soia (0,44 t/ha-anno), del girasole (0,78 t/ha-anno), della colza (1,17 t/ha-anno) e della palma da olio (6,0 t/ha-anno), ma inferiore alla resa teorica delle microalghe (fino a 73 t/ha-anno, per Nannochloropsis sp.). Poiché Azolla/A. azollae contengono una gamma di acidi grassi C16:0, C18:2 e C18:3, la loro conversione in esteri metilici significa che il biodiesel risultante soddisfa i requisiti cruciali di densità del carburante, numero di cetano e valore di iodio per il biodiesel stabiliti dalla norma EN14214 .

Produzione di etanolo

La produzione teorica di etanolo da A. filiculoides è di 9,3 t/ha-anno (11,7 × 103 L/ha/anno, sulla base del volume specifico di etanolo = 0,789 g/mL) che è inferiore alla produzione di etanolo dalla canna da zucchero (25 × 103 L/ha-anno), vicina a quella dalle stoppie di mais (13.31 × 103 L/ha-anno), ma superiore a quella del miscanto (2,3 × 103 L/ha-anno), del salice (0,3 × 103 L/ha-anno) e del pioppo (1,3 × 103 L/ha-anno) (Additional file 1: Table S1).2 mol/mol di substrato rendono l’Azolla una materia prima competitiva per la produzione di idrogeno rispetto ad altre colture bioenergetiche (Additional file 1: Tabella S1, Additional file 10: Tabella S6).