Aquatic plant Azolla as the universal feedstock for biofuel production

Treatment of synthetic wastewater with Azolla filiculoides

Do eksperymentu bioremediacji, bogaty w selen syntetyczny ściek (SeSW) został przygotowany przez zmieszanie wysokiego stężenia fosforanów (PO4-P), 1.3 g/L z umiarkowaną ilością amoniaku (NH4-N), 55 mg/L i niskim stężeniem azotanów (NO3-N), 15 mg/L (Dodatkowy plik 4: Tabela S3). Skład ten symuluje charakterystykę ścieków z typowych zakładów przemysłu tekstylnego zajmujących się barwieniem, wykańczaniem i produkcją detergentów do prania. Ścieki uzupełniono o 0,8 mg/L SeO2. W tym doświadczeniu zastosowano 5-dniowe oczyszczanie SŚB przez A. filiculoides. Tempo wzrostu niektórych roślin wodnych rosnących na ściekach zwykle wzrasta wykładniczo po fazie lag obserwowanej przez pierwsze 4-5 dni, kiedy biomasa nie ulega znaczącym zmianom. Okres ten jest jednak związany z intensywną absorpcją kluczowych składników odżywczych ze ścieków, co prowadzi do silnego wykładniczego wzrostu roślin wodnych po fazie lag. Usuwanie składników pokarmowych w SeSW w ciągu pierwszych 5 dni oczyszczania przez A. filiculoides nie spowodowało statystycznie istotnych zmian (P ≤ 0,05) w produkcji biomasy (0,3 ± 0,1 g dw). Doprowadziło natomiast do 25,4 % pobrania NH4-N, 69,5 % pobrania NO3-N i 24,3 % pobrania PO4-P ze 100 % SeSW (tab. 1; rys. 1). Rozcieńczona (50 %) SeSW była mniej stresogenna dla A. filiculoides, co znalazło odzwierciedlenie w wyższych wskaźnikach pobrania składników pokarmowych: 33,4, 93 i 39,8 % odpowiednio dla NH4-N, NO3-N i PO4-P. Wskaźniki absorpcji składników pokarmowych przez A. filiculoides były podawane wcześniej przez kilka grup badawczych .

Traktowanie SeSW przez A. filiculoides prowadziło do 40 % pobrania Se z 100 % SeSW i 76 % z 50 % SeSW z wydajnością absorpcji odpowiednio 47,6 µg Se/L dzień i 39,9 µg Se/L dzień (Rys. 2; Tab. 2). Było to skorelowane z poziomem akumulacji w A. filiculoides 158,8 µg Se/g dw-dobę z 100 % SeSW i 133,5 µg Se/g dw-dobę z 50 % SeSW (tab. 2). Ta wydajność absorpcji stanowi 85 i 83 % teoretycznej maksymalnej wartości absorpcji odpowiednio dla 50 % SeSW i 100 % SeSW. W przybliżeniu podobne tempo absorpcji Se wykazał inny przedstawiciel Azolla, Azolla caroliniana, który zaabsorbował do 1 mg Se/g dw z 2,5 mg/L roztworu Se w ciągu 2 tygodni leczenia. Jest to wartość wyższa niż w przypadku innych roślin wodnych, Salvinia rotundifolia (0,7 mg Se/g dw), Lemna minor (500 mg Se/g dw) i Eichhornia (300 mg Se/g dw) .

Przeżywalność P. australiensis eksponowanego na rozcieńczenia SeSW przedstawiono w pliku dodatkowym 5: Rysunek S2. Zerowa przeżywalność (0 %) wystąpiła, gdy wystawiono je na 96 h na 100 % nietraktowanej (kontrolnej) SeSW. W 80 % lub 50 % SeSW również nie zaobserwowano żywych krewetek. Po potraktowaniu A. filiculoides toksyczność SeSW zmniejszyła się 2,6-krotnie, a LC50 wzrosło z 11,22 do 29,80 %. Wskazało to, że gdy 100 % SeSW zostało potraktowane A. filiculoides, jego toksyczność została znacznie zmniejszona już po 5 dniach leczenia.

Produkcja biopaliwa z Azolla

Analiza ogólna i proksymalna Azolla filiculoides

Wyniki analiz proksymalnych i ostatecznych próbki A. filiculoides, w tym całkowita zawartość lotnych związków, wilgoci, węgla stałego i popiołu (tj. nieorganicznych składników próbek), są podsumowane w pliku dodatkowym 6: Tabela S4. Całkowita zawartość lotnych związków zebranych w temperaturze 950 °C stanowi 88 % całkowitego produktu. Całkowity produkt zawierał 11 % wilgoci, 7,3 % popiołu i 4,4 % węgla stałego. Analiza proksymatyczna wykazała, że kluczowe elementy zawierają 46,2 % C, 7,4 % H, 3,0 % N, 43,2 % O i 0,2 % S (obliczone przez różnicę).

Analizy termograwimetryczne Azolla filiculoides

Analizę TGA-DTG próbki A. filiculoides przeprowadzono w zakresie temperatur 23-900 °C z szybkością ogrzewania 10 °C/min w atmosferze azotu i przedstawiono na Rys. 3. Krzywe TGA i DTG wykazały trzy etapy rozkładu A. filiculoides w procesie pirolizy; podobne wyniki podali Agrawal i Chakraborty . Biomasa przechodziła trzy fazy utraty masy, jedną pomiędzy 154 i 160 °C, drugą w 180 i 580 °C i trzecią w około 580 i 900 °C. Pierwsza strefa reprezentuje niewielki ubytek masy (7 %) spowodowany dehydratacją próbki biomasy. Większość ubytku masy (51 %) w wyniku pirolizy miała miejsce w drugiej strefie, gdzie uwalnia się większość lotnych związków; silny pik oznacza rozkład białek, węglowodanów i lipidów. W trzeciej strefie następuje rozkład produktu węglowego, a więc ubytek masy wynika głównie ze zgazowania, gdzie wysoko nielotne związki węglowe pod wpływem wysokiej temperatury odparowują tworząc CO i CO2 .

Hydrotermiczne upłynnianie Azolla filiculoides

Hydrotermiczne upłynnianie A. filiculoides przeprowadzono przy użyciu wody destylowanej jako rozpuszczalnika w temperaturach 260, 280 i 300 °C z czasem przebywania 15 min. Warunki reakcji zostały wybrane na podstawie naszych wcześniejszych badań i literatury, aby zrozumieć wpływ temperatury na wydajność produktu bio-oleju z A. filiculoides w wodzie podkrytycznej. Rozkład produktów z próbki A. filiculoides poddanej obróbce HTL przedstawiono na Rys. 4. Całkowity uzysk biooleju wynosił 15,83, 21,50 i 16,0 % odpowiednio w temperaturach 260, 280 i 300 °C; maksymalną wydajność uzyskano w temperaturze 280 °C. Całkowity bioolej składał się z frakcji eterowej (Bio-oil1) otrzymanej w wyniku ekstrakcji części ciekłej i frakcji acetonowej (Bio-oil2) otrzymanej w wyniku ekstrakcji frakcji stałej (sekcja „Metody”). Bio-oil2 miał wysoką lepkość i był postrzegany jako smolista ciecz. Wydajność pozostałości stałej spadała w sposób ciągły z 66,83 do 33,83 % wraz ze wzrostem temperatury z 260 do 300 °C. Wydajność gazów zmniejszyła się w okresie przejściowym od 260 do 280 °C. Gdy temperatura była wyższa niż 280 °C, wydajność gazów wzrosła do 7,1 %. HTL biomasy A. filiculoides wykazała podobny rozkład dwóch głównych produktów, biogazu i biowęgla, do danych uzyskanych po pirolizie, ze średnią zawartością biogazu 6,05 i 12 %, odpowiednio dla HTL i pirolizy, oraz biowęgla około 50 % dla obu. HTL generuje wyższy poziom biooleju, do 21,5 % (14 % w przypadku pirolizy). Podobne wyniki uzyskano w porównaniu z wydajnością biooleju otrzymanego zarówno z pirolizy jak i HTL mikroalg .

W uzupełnieniu do danych z bilansu materiałowego zbadano konwersję na podstawie całkowitego węgla organicznego (TOC) uzyskanego po hydrotermalnym upłynnieniu w różnych temperaturach, a wyniki przedstawiono w pliku dodatkowym 7: Tabela S5. Zawartość węgla organicznego w nadawie wynosiła 46,9%, co przekłada się na 2,8 g węgla organicznego w 6 g próbki użytej do hydrotermalnego upłynniania. Konwersja dotycząca węgla organicznego wzrosła z 13,93 do 48,93 % wraz ze wzrostem temperatury z 260 do 300 °C. Wyniki wskazują, że w niższej temperaturze rozkład biomasy był niekompletny i pozostawała duża ilość nieprzereagowanej biomasy, która może hamować tworzenie bio-oleju. Wzrost temperatury przyspieszał rozkład materiału wsadowego i sprzyjał tworzeniu się biooleju, jednak dalszy wzrost temperatury, powyżej 280°C w naszych eksperymentach, powodował rozkład wcześniej utworzonego biooleju/produktów pośrednich do gazów i produktów rozpuszczalnych w wodzie, co prowadziło do spadku wydajności biooleju. Zmniejszona wydajność pozostałości stałej (bio-szlamu) sugeruje wzrost ogólnej konwersji biomasy, gdy temperatura została podniesiona z 260 do 300 °C.

Fourier transform-infrared spectroscopy of bio-oil

FT-IR spectra of the A. filiculoides oraz bio-oleju1 otrzymanego w procesie HTL w temperaturze 260, 280 i 300 °C przedstawiono na Rys. 5A i B. Szerokie pasmo przy około 3200-3405 cm-1 przypisano drganiom rozciągającym O-H lub N-H spowodowanym przez wodę lub grupy O-H lub grupy N-H obecne w bio-oleju (Rys. 5B). Szeroka absorbancja pojawiła się przy ok. 3314 cm-1 dla surowca, co wskazywało na wysoką zawartość węglowodanów i białek (Rys. 5A).

The bio-oils showed a weak weaker absorbanance at 3200-3405 cm-1, suggesting that both carbohydrates and proteins were decomposed in the HTL process (Fig. 5B). Pasma od 2854 do 2950 cm-1 były silniejsze dla wszystkich bioolejów ze względu na drgania rozciągające C-H, wskazujące na obecność alkilowych grup C-H. Wibracje rozciągające C=O przy 1645-1720 cm-1 w bioolejach wskazują na obecność ketonów, aldehydów, estrów lub kwasów. Pasma drgań zginających przy ok. 1580-1650 cm-1 wskazują na obecność grup N-H amin. Pasma w obszarze od 1430 do 1480 cm-1 przypisano drganiom zginającym α-CH2 obecnym w bio-olejach. Obecność pasm rozciągania C-N w okolicach 1266-1342 cm-1 w bio-olejach jest spowodowana aromatycznymi grupami aminowymi. Również kilka innych pików absorbancji pojawiających się przy 780-850 cm-1 przypisuje się drganiom zginającym C-H pochodzącym od aromatów. Pasmo przy 1040 cm-1 pojawiło się tylko w profilu absorpcji paszy A. filiculoides i może być C-O związane z grupami hydroksylowymi, które uległy dehydratacji po upłynnieniu. Ogólnie rzecz biorąc, widma próbek bio-oleju1 z HTL w różnych temperaturach wykazują te same piki, wskazujące na obecność tych samych grup funkcyjnych, i były różnymi pikami uzyskanymi w widmach NMR.

Analiza NMR bio-oleju

Analiza NMR próbek bio-oleju1 została podjęta w celu zrozumienia stosunków chemicznych środowisk protonów. Widma NMR dostarczyły komplementarnych informacji o grupach funkcyjnych do widm FTIR oraz możliwość ilościowego określenia i porównania obszarów integracji pomiędzy widmami. Podobnie jak w przypadku FT-IR, widma 1H NMR wykazały wysoki udział alifatycznych grup funkcyjnych we wszystkich bio-olejach, a podsumowanie zintegrowanych obszarów powierzchni pików przypisanych do różnych klas grup funkcyjnych przedstawiono na Rys. 6. Najbardziej wznoszący się region widma, od 0,5 do 1,5 ppm, reprezentuje protony alifatyczne przyłączone do atomów węgla w odległości co najmniej dwóch wiązań od C=C lub heteroatomu (O lub N). Następny integralny region od 1,5 do 3,0 ppm reprezentuje protony na alifatycznych atomach węgla, które mogą być połączone z podwójnym wiązaniem C=C. Wszystkie biooleje miały wyższy procent protonów w regionie spektralnym od 0,5 do 3,0 ppm. Miały one wyższy procent (63,15-71,76 %) protonów w regionie od 0,5 do 1,5 niż w regionie od 1,5 do 3,0 (18,73-28,8 %), co jest prawdopodobnie spowodowane dużą liczbą związków azotowych i tlenowych, które rezonują w tym obszarze, a które mogą pochodzić z wysokiej zawartości białka w surowcu.

Kolejna część widma 1H NMR przy 3,0-4,5 ppm reprezentuje protony metoksylowe lub grupę metylenową łączącą dwa pierścienie aromatyczne; w tym regionie zaobserwowano bardzo niski procentowy udział protonów. Wszystkie biooleje wykazywały niski procentowy udział funkcji metoksy/węglowodanowej (4,5-6,0 ppm). W tym regionie, maksymalne wartości procentowe protonów bioolejów wynosiły 4,33 i 4,32 % dla upłynniania w 260 i 280 °C, wyraźnie niższa wartość 0,94 % dla upłynniania w 300 °C. Obszar widma pomiędzy 6,0 i 8,5 ppm odpowiada obszarowi aromatycznemu. Maksymalną zawartość protonów wynoszącą około 7,2 % w tym regionie uzyskano dla biooleju wytworzonego w temperaturze 300 °C. Aromatyczna/heteroaromatyczna funkcjonalność została zaobserwowana we wszystkich bioolejach (6,0-8,5 ppm), co jest zgodne z wynikami spektroskopii FT-IR. Obszary widma w dole pola (8,5-10 ppm) pochodzą od aldehydów. Funkcjonalność aldehydowa (9,5-10,0 ppm) była nieobecna we wszystkich bioolejach pomimo grup funkcyjnych C=O (1645-1720 cm-1) obserwowanych przez FT-IR. Pojawienie się takich pasm FT-IR może być również spowodowane innymi grupami przenoszącymi karbonyl, takimi jak protonowane kwasy karboksylowe, estry kwasów karboksylowych, amidy i ketony.

Analiza GC-MS bio-oleju

GC-MS została wykorzystana do dalszego zrozumienia składu ciekłego produktu i potwierdzenia wyników analiz FT-IR i NMR. GC-MS wyraźnie pokazało, że temperatura skraplania wpływa na składniki bio-oleju1. Identyfikację głównych pików związków przeprowadzono przy użyciu bazy danych widm masowych NIST. W wyniku eksperymentów HTL otrzymano biooleje, które powstały w wyniku rozkładu ligniny, białek, flawonoidów i lipidów oraz szeregu związków węglowodanopochodnych. Składniki bioolejów zidentyfikowano jako jedno- i wielopierścieniowe związki aromatyczne, ketony, aldehydy, estry, alkohole, amidy i inne związki zawierające azot (w tym amidy i związki N-heterocykliczne) oraz węglowodory. Analizę półilościową przeprowadzono obliczając względny procent powierzchni pików chromatograficznych, a wyniki przedstawiono w tabeli 3. Główne związki zaobserwowane w wyniku hydrotermalnego upłynniania A. filiculoides były: pirazyna metylowa, 2-metylo-2-cyklopenten-1-on, fenol, 2-metoksyfenol, 3-pirydynol, katechol, l-prolina, ester N-butoksykarbonylo-butylowy, ftalan bis(2-etyloheksylu) i beta-sitosterol. Wraz ze zmianą temperatury upłynniania hydrotermalnego w zakresie od 260 do 300 °C następowało wytwarzanie różnych związków, a także różne ich proporcje. Procent powierzchniowy związków fenolowych takich jak fenol (6,1-18,8 % powierzchni) i katechol (10,0-15,7 % powierzchni) wzrastał wraz ze wzrostem temperatury z 260 do 280 °C, ale następnie zmniejszył się do 11,1 % powierzchni dla fenolu i 11,8 % powierzchni dla katecholu dla 300 °C. Fenole w bio-oleju z A. filiculoides zostały prawdopodobnie wytworzone z ligniny lub węglowodanów biomasy. Związki nitrogenizowane powstają w wyniku reakcji dekarboksylacji, deaminacji, dehydratacji, depolimeryzacji i rozkładu białek. Najwyższy procentowy obszar 3-pirindiolu (13,3 % powierzchni) zaobserwowano w najniższej temperaturze 260 °C i zmniejszył się do 11,9 i 10,1 % powierzchni odpowiednio dla 280 i 300 °C. Ponadto zaobserwowano najwyższy obszar około (13,6, 12,4 i 8,7 % powierzchni) w temperaturach 260, 280 i 300 °C. Ponieważ skład ciekłego produktu jest tak złożony, dalsze uszlachetnianie, takie jak odazotowanie i odtlenienie, byłoby konieczne, aby uczynić bioolej odpowiednim do paliw silnikowych.

Skład molekuł uzyskanych w bio-oleju z HTL porównano ze spektrum molekuł zidentyfikowanych w bio-oleju wytworzonym w wyniku pirolizy. W przeciwieństwie do HTL, piroliza jest termochemicznym rozkładem suchej materii organicznej o zawartości wilgoci poniżej 10 % ułamka masowego w nieobecności tlenu, pod ciśnieniem atmosferycznym i w wyższych temperaturach (350-550 °C). Obie technologie termochemiczne wykazały duży potencjał w przetwarzaniu całej biomasy Azolla na biooleje, które mają wyższą gęstość energetyczną niż wyjściowy surowiec biomasowy. Bio-oleje z obu termochemicznych reakcji mają bardzo złożony skład, będący wynikiem depolimeryzacji i rozkładu monomerów biomasy poprzez rozszczepienie, dehydratację, dekarboksylację i deaminację. Związki białkopochodne reprezentowane były przez fenole, alkilofenole, pirolidynon, indol i nitryl w wyniku rozkładu aminokwasów tyrozyny i fenyloalaniny występujących w Azolli. Produkty pochodzące z lipidów obejmowały szereg długołańcuchowych nasyconych alkanów i kwasów tłuszczowych o rozmiarach od C12 do C21: dodekan, tridekan, tetradekan, pentadekan, heksadekan, heptadekan, oktadekan, nonadekan, eikozan i heneikozan. Podobną mieszaninę długołańcuchowych alkanów pochodzących z lipidów, będących produktami pirolizy, stwierdzono w algach. Główną różnicą było to, że piroliza A. filiculoides wykazała akumulację fitolu, 3,7,11,15-tetrametylo-2-heksadecen-1-olu, acyklicznego alkoholu diterpenowego, jako produktu degradacji chlorofilu, który był najbardziej obfitym produktem pirolizy.

Analiza produktów biopozostałości

Rycina 7 przedstawia widma FT-IR paszy Azolla i biopozostałości. Szerokie pasma przy 3200-3405 cm-1 są przypisane do drgań rozciągających grup O-H z wiązaniami wodorowymi i grup N-H i wskazują na obecność polisacharydów, węglowodanów i białek obecnych w paszy Azolla. Początkowa pasza Azolla ma silne piki drgań rozciągających odpowiadające grupom O-H i N-H, ale transmitancja ta zmniejsza się w bio-rezerwuarze. Pik przy 1030 cm-1 zniknął w bio-żywicy. Pik około 1600-1620 cm-1 odpowiadający drganiom zginającym N-H był obecny w paszy Azolla i bio-rezerwuarze Azolla. Piki pomiędzy 2800 a 2930 cm-1 w widmach pozostałości stały się znacznie słabsze niż w surowej paszy Azolla. Obecność pojedynczego piku przy 1590 cm-1, przypisywanego rozciąganiu C=C, wskazuje na tworzenie się aromatycznego biowęgla .

Widma rentgenowskiej dyfrakcji proszkowej (XRD) paszy A.filiculoides i bio-residues w różnych temperaturach nie wykazały istotnych różnic w proszkowym dyfraktogramie rentgenowskim (plik dodatkowy 8: Rysunek S3). Pasza i pozostałości z biomasy otrzymane w różnych temperaturach wykazywały typową amorficzną naturę, wskazującą, że struktura węgla w pozostałościach jest wysoce sprzężona, aromatyczne arkusze usieciowane w sposób przypadkowy. Zmiany morfologiczne były widoczne na obrazach skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) azolli i bio-pozostałości (Dodatkowy plik 9: Rysunek S4). Obrazy bio-pozostałości otrzymanej w wyniku hydrotermalnego upłynniania trzech biowłókien Azolla wykazały, że pozostałość ma charakter gąbczasty i nie ma uporządkowanej struktury porowatej.

Produkcja wodoru z biomasy Azolla poddanej działaniu kwasu przez Enterobacter cloacae DT-1

Poddana wstępnej obróbce cieplnej z użyciem H2SO4, biomasa A. filiculoides była hydrolizowana do różnych rozpuszczalnych cukrów zredukowanych składających się głównie z glukozy (1,18 g/L), ksylozy (1,39 g/L) i arabinozy (0,063 g/L). Wstępny hydrolizat poddany działaniu kwasu został użyty jako substrat do produkcji wodoru przez Enterobacter cloacae (E. cloacae) w trybie wsadowym przy obniżonym ciśnieniu parcjalnym pH2. pH2 znacząco wpływa na wydajność produkcji wodoru przez bakterie beztlenowe, ponieważ szlaki produkcji wodoru są wrażliwe na stężenie wodoru, co prowadzi do zahamowania produktu końcowego. Stwierdzono, że wysokie ciśnienie cząstkowe wodoru skutkuje produkcją większej ilości produktów zredukowanych, takich jak etanol i mleczan, zamiast octanu, maślanu i H2. Fermentator okresowy był ustawiony w taki sposób, aby wywierać ciśnienie na przestrzeń czołową fermentatora, co pozwoliło biogazowi wydostać się z przestrzeni czołowej natychmiast po jego wytworzeniu, zmniejszając w ten sposób całkowite ciśnienie cząstkowe, a tym samym ciśnienie cząstkowe wodoru w fermentatorze okresowym.

Fermentacja z E. cloacae DT-1 doprowadziła do wytworzenia 53 mmol/L wodoru (Tabela 4). Podczas fermentacyjnej produkcji wodoru, końcowe pH bulionu fermentacyjnego spadło z 7,5 do 5,42, co można przypisać produkcji krótkołańcuchowych organicznych kwasów tłuszczowych. Całkowita produkcja lotnych kwasów tłuszczowych wynosiła 1150 mg/L, składając się głównie z kwasu octowego (986 mg/L) i masłowego (161 mg/L), przy stosunku B/A wynoszącym 0,165. Szczep DT-1 podążał mieszaną ścieżką kwasową i efektywnie wykorzystywał cukry C5 (ksylozę, arabinozę i glukozę) z prehydrolizatu poddanego działaniu kwasu. Wydajność produkcji wodoru wynosiła 2,43 mol H2/mol cukru redukującego. Ponieważ maksymalna teoretyczna wydajność produkcji wodoru w procesie ciemnej fermentacji wynosi 4 mol H2/mol glukozy, około 60% maksymalnej możliwej wydajności wodoru uzyskano z prehydrolizatu biomasy poddanej działaniu kwasu. Według naszej najlepszej wiedzy, jest to pierwszy raport dotyczący produkcji wodoru z cukrów biomasy A. filiculoides.

Produkcja wodoru z enzymatycznie traktowanej biomasy Azolla przez E. cloacae DT-1

Enzymatyczna hydroliza kwasowo traktowanej biomasy A. filiculoides uwalniała glukozę i ksylozę w stężeniu odpowiednio 1,49 i 0,181 g/L. Z enzymatycznie hydrolizowanych cukrów biomasy uzyskano około 34,8 mmol/L objętościowej produkcji wodoru (przy obniżonym pH2). Podczas produkcji wodoru końcowe pH wywaru fermentacyjnego spadło do 5, czemu towarzyszyła produkcja kwasu octowego (990 mg/L) i masłowego (164 mg/L). Całkowite stężenie VFA wynosiło 1156 mg/L, a stosunek B/A wynosił 0,165 (tab. 4). Wyniki te wskazują, że zachodziła mieszana ścieżka fermentacji kwasowej. Wydajność produkcji wodoru wynosiła 2,04 mol H2/mol cukru redukującego, a więc była niższa niż uzyskana z prehydrolizatu poddanego obróbce kwasem. Całkowita wydajność produkcji wodoru przez szczep DT-1 z biomasy Azolla filiculoides wynosiła 2,2 ± 2 mol/mol cukru redukującego. Wydajność produkcji wodoru z Azolla jest podobna do tej uzyskanej dla lądowych surowców lignocelulozowych, która obejmuje zakres 044-2.76 mol H2/mol cukrów (Dodatkowy plik 1: Tabela S1, Dodatkowy plik 10: Tabela S6).

Stosunek węgla do azotu (C/N) w biomasie jest ważny dla efektywnej fermentacji beztlenowej, ponieważ mikroorganizmy wymagają znacznie więcej C niż N (C:N z 25:1) do optymalnej produkcji wodoru. Z tego powodu, zastosowanie mikroalg do produkcji wodoru jest ograniczone, ponieważ są one bogate w białka i mają niski stosunek C/N (średnio 4). Współfermentacja z makroalgami (takimi jak Laminaria digitata), które są bogate w węglowodany o wysokim stosunku (C/N), poprawia wydajność produkcji wodoru. A. filiculoides zawiera 41 % całkowitych węglowodanów i 20 % białek, w wyniku czego analiza proksymalna biomasy wykazała C/N na poziomie 15 (plik dodatkowy 6: Tabela S4), który jest bliski bycia wydajnym surowcem do produkcji biowodoru.

Produkcja etanolu z Azolla filiculoides i A. pinnata

Analiza chemiczna biomasy A. filiculoides i A. pinnata jest pokazana w pliku dodatkowym 3: Tabela S2. A. filiculoides wykazała wysoką koncentrację biomolekuł, które mogą być wykorzystane jako surowiec do produkcji bioetanolu: skrobia (6,05 %), celuloza (21,8 %) i hemiceluloza (13,5 %). Zawiera 10,3 % ligniny, co jest wartością wyższą niż u kaczenic i innych roślin wodnych, ale niższą niż u głównych lignocelulozowych roślin bioenergetycznych (Dodatkowy plik 1: Tabela S1). Analiza chemiczna A. pinnata wykazała niższą koncentrację cząsteczek produkujących bioetanol: skrobi (4,7%), celulozy (12,8%) i hemicelulozy (10,1%) oraz wyższą zawartość ligniny (do 13,2%).

Składnik skrobiowy A. filiculoides i A. pinnata był enzymatycznie hydrolizowany przez α-amylazę i α-amyloglukozydazę, a składniki celulozy/hemicelulozy były hydrolizowane przez celulazę i celobiazę. Ilości uwolnionej glukozy przedstawiono w tabeli 5. Zgodnie z oczekiwaniami, kombinacja czterech enzymów hydrolizujących biomasę A. filiculoides wytworzyła większą ilość glukozy niż w przypadku A. pinnata (odpowiednio do 65,9 i 29,5 g/L). Ta wydajność glukozy była znacznie wyższa niż po potraktowaniu biomasy A. filiculoides zawiesiną żywego Aspergillus niger wyhodowanego na bulionie dekstrozy ziemniaczanej (2,5 g/L glukozy), co wykazali Pandey i wsp.

Po fermentacji zredukowanych cukrów przy użyciu Saccharomyces cerevisiae wydajność etanolu, YE/G (etanol/glukoza, g/g) odzwierciedlała ilość uwolnionej glukozy w próbkach, z wydajnością 0,56 g/g zaobserwowaną dla A. filiculoides i 0,28 g/g dla A. pinnata. Wydajność 0,56 g/g jest porównywalna z wynikami uzyskanymi podczas fermentacji hydrolizatów z kaczek i niektórych roślin energetycznych (Dodatkowy plik 1: Tabela S1). Co ciekawe, dodanie do fermentacji dodatkowych składników odżywczych nie wykazało znaczącego wzrostu wydajności etanolu (nie pokazano). Można to wytłumaczyć obecnością kluczowych dla wzrostu drożdży składników odżywczych w biomasie obu gatunków Azolla.

Wydajność etanolu z biomasy A. filiculoides (YE/B) określono na 0,09 g/g, co jest zbliżone do wydajności z S. cerevisiae ATCC 24859 wyhodowanej na kaczanach L. minor, które zawierały średnio 10% skrobi. Wyższą wydajność etanolu, 0,19 g/g, zaobserwowano dla szczepu Lemna aequinoctialis 6000, który charakteryzuje się szybkim tempem wzrostu i zdolnością do akumulacji wysokiego poziomu skrobi (do 39%). Potencjał innego przedstawiciela kaczeńców, Spirodela polyrrhiza, do zwiększania poziomu skrobi w warunkach stresowych do 45,7 % wraz z hydrolizą enzymatyczną przy użyciu α-amylazy, pullulanazy i α-amyloglukozydazy doprowadził do YE/B wynoszącego 0,28 g/g. Skład chemiczny ścian komórkowych i mniejsza akumulacja skrobi były prawdopodobną przyczyną niższej wydajności etanolu z biomasy A. pinnata (YE/B = 0,05 g/g). Wykorzystanie różnych szczepów drożdży, które mogą lepiej fermentować spektrum uwolnionych cukrów i są bardziej tolerancyjne na potencjalne inhibitory, będzie kolejnym krokiem w optymalizacji wydajności etanolu z biomasy Azolli.

Azolla jako uniwersalny surowiec do produkcji biopaliw

Systematyczna analiza roślin lądowych pod kątem ich potencjału do bycia idealnymi uprawami bioenergetycznymi doprowadziła do ustalenia kilku ważnych kryteriów wyboru, które obejmują: (1) skład chemiczny i wysoki udział cząsteczek produkujących biopaliwa; (2) wysokie tempo wzrostu/produkcji biomasy; (3) wysoki indeks zbioru/okres rotacji; (4) zdolność do uprawy na gruntach marginalnych i brak konkurencji z roślinami rolniczymi o grunty orne; (5) wysoką wydajność wykorzystania wody słodkiej i niski koszt uprawy; (6) niski koszt zbioru; oraz (7) produkcję wysokowartościowych produktów ubocznych . Kryteria te spowodowały intensywne poszukiwania w zakresie udomowienia następnej generacji roślin energetycznych.

Gatunki Azolla wraz z ich ewolucyjnym symbiontem cyjanobakteryjnym, A. azollae, przyciągnęły uwagę ze względu na ich potencjał do spełnienia wszystkich wyżej wymienionych kryteriów. Po pierwsze, biomasa Azolli zawiera główne rodzaje cząsteczek energetycznych, w tym celulozę/hemicelulozę, skrobię i lipidy, przypominając kombinacje lignocelulozowych, skrobiowych i olejowych lądowych roślin bioenergetycznych oraz mikroalg/cyanobakterii. Po drugie, dzięki podwajaniu biomasy co 5-6 dni i wysokiej rocznej produktywności, są one jednymi z najszybciej rosnących roślin, zajmując drugie miejsce po mikroalgach pod względem szybkości produkcji biomasy. Podobnie jak w przypadku mikroalg ich produkcja biomasy nie jest sezonowa. Po trzecie, Azolla może być efektywnie uprawiana poza swoim naturalnym środowiskiem, wykorzystując ścieki jako główne źródło składników odżywczych. Bioremediacja ścieków może prowadzić do absorpcji do 2,6 i 0,434 t/ha-rok całkowitego N i P, odpowiednio. Azolla może również rosnąć efektywnie w podłożach ubogich w N, asymilując do 0,4 t N/ha-rok azotu z atmosfery poprzez symbiozę z A. azollae. Po czwarte, są one łatwe do zbioru. I wreszcie, gatunki Azolla są używane od dziesięcioleci jako bio-nawozy azotowe i pasza dla zwierząt hodowlanych/ryb (ze względu na wysoki poziom białka i węglowodanów). Brak konieczności stosowania syntetycznych nawozów azotowych w uprawie Azolli ma znaczący pozytywny wpływ na ograniczenie wytwarzania podtlenku azotu (N2O), którego wpływ na ocieplenie atmosfery jest prawie 300 razy większy niż dwutlenku węgla .

Technologie termochemiczne

Biomasa Azolli została wykorzystana jako surowiec do produkcji biooleju, bio-charu i biogazu przy zastosowaniu dwóch technologii termochemicznych, pirolizy i HTL (niniejsza praca). Biorąc pod uwagę wysoką roczną produktywność Azolla, prowadzi to do teoretycznej produkcji bioolejów opartych na pirolizie i HTL, wycenianych odpowiednio na 13,2 i 20,2 t/ha-rok. Oba biooleje zawierają szereg substancji petrochemicznych, które mogą być bezpośrednio wykorzystane jako wolne od gliceryny składniki biodiesla lub mogą być uszlachetnione do biopaliw przy użyciu pewnych dobrze znanych technologii. Obie technologie termochemiczne mogą również produkować bio-solidy, takie jak bio-szlam i popiół (do 48 t/ha-rok dla obu), które mogą być wykorzystane do poprawy jakości gleby poprzez zwiększenie jej zdolności zatrzymywania składników odżywczych i wilgoci, wspieranie społeczności mikrobiologicznych i promowanie aktywności korzeni. Popiół z Azolla zawiera pierwiastki alkaliczne (Li, Na, K, Mg, Ca), jak również mikroelementy takie jak Fe, Mn i Cu, co czyni go dobrym kandydatem do wykorzystania jako nawóz.

Produkcja biodiesla

Przy uprawie na ściekach, roczna teoretyczna wydajność surowych lipidów z A. filiculoides może być oszacowana na 1,68 t/ha-rok. Ilość ta może być zwiększona do 8 t/ha-rok, jeśli roślina będzie rosła w warunkach naturalnych z wydajnością około 100 t dw/ha-rok. Taka wydajność oleju jest znacznie wyższa niż z soi (0,44 t/ha-rok), słonecznika (0,78 t/ha-rok), rzepaku (1,17 t/ha-rok) i palmy olejowej (6,0 t/ha-rok), ale niższa niż teoretyczna wydajność z mikroalg (do 73 t/ha-rok, dla Nannochloropsis sp.). Ponieważ Azolla/A. azollae zawierają szereg kwasów tłuszczowych C16:0, C18:2 i C18:3, ich konwersja do estrów metylowych oznacza, że otrzymany biodiesel spełnia kluczowe wymagania gęstości paliwa, liczby cetanowej i wartości jodowej dla biodiesla określone w normie EN14214.

Produkcja etanolu

Teoretyczna produkcja etanolu z A. filiculoides wynosi 9,3 t/ha-rok (11,7 × 103 L/ha-rok, w oparciu o objętość właściwą etanolu = 0,789 g/mL), która jest niższa niż produkcja etanolu z trzciny cukrowej (25 × 103 L/ha-rok), zbliżona do produkcji z resztek kukurydzy (13.31 × 103 L/ha-rok), ale wyższa niż z miskanta (2,3 × 103 L/ha-rok), wierzby (0,3 × 103 L/ha-rok) i topoli (1,3 × 103 L/ha-rok) (Dodatkowy plik 1: Tabela S1).

Produkcja biowodoru

Wysoka wydajność produkcji biomasy, skład chemiczny (stosunek C/N) i wysoka wydajność biowodoru wynosząca 2.2 mol/mol substratu sprawiają, że Azolla jest konkurencyjnym surowcem do produkcji wodoru w porównaniu z innymi roślinami bioenergetycznymi (plik dodatkowy 1: Tabela S1, plik dodatkowy 10: Tabela S6).