Materiais
4′-Hidroxiazobenzeno-2-carboxílico (HABA), biotina, N-(2-aminoetil)sal trifluoroacetato maleimida (amino-maleimida), ácido acético, acetato de sódio, ácido fosforoso, cloreto de magnésio, Tween 20, Tween 80, albumina de soro bovino (BSA), dimetil sulfóxido (DMSO), dextrano (Dex; MW 15-25 kg mol-1-Mn 16 kg/mol; liofilizado antes do uso), 4-nitrofenil clorofórmio (PNC; sublimado antes do uso), LiCl (seco a 110 °C antes do uso), tiramina (TA), piridina anidra, N,N-dimetilformamida anidra (DMF), N,N-Diisopropilmetilamina (DIPEA), piperidina, aminoácidos, anidrido acético, triisopropilsilano, ácido trifluoroacético (TFA), hidróxido de sódio (NaOH), N-Boc-1,4-butanodiamina (NH2-Boc), bicarbonato de sódio (NaHCO3), biotina-atto565, biotina-4-fluoresceína (biotina-FITC), 6-aminofluoresceína, peroxidase de rábano (HRP, tipo VI), biotina-HRP, peróxido de hidrogênio (H2O2; com inibidor), soro fetal bovino (FBS), calceína AM, homodímero-1 de etídio (EthD-1), tiazolyl Blue Tetrazolium Blue (MTT), e todos os outros solventes, a menos que de outra forma indicado, foram adquiridos da Sigma-Aldrich. O mestre em forma de osso foi comprado à LEGO. O polidimetilsiloxano (PDMS; Sylgard 184) foi comprado da Dow Corning. O tampão fosfato salino (PBS) foi comprado à Lonza. Recombinante humano BMP7 (354-BP-010), 3,3′,5,5′-tetrametilbenzidina (TMB), e H2SO4 foram comprados da R&D Systems. A resina Fmoc-Rink 4-metilbenzilamina (MBHA) (escala de 50 mg, substituição 0,52 mmol g-1) e N,N,N′,N′-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorofosfato (HBTU) foram comprados da MultiSynTech. Clorofórmio e 1-metil-2-pirrolidinona (NMP) foram comprados da WR Chemicals. Anticorpo VHH contra BMP7 (Q32c-lab, clone G7) e anticorpo policlonal de coelho contra VHH (K1216) foram comprados da QVQ. O anticorpo Biotinylated IL-1β (508301, clone JK1B2, RRID:AB_315512) foi comprado da Biolegend. Biotinylated IgG (Biotin-SP AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG; 711-065-152) foi comprado da Jackson Immunoresearch. O anticorpo secundário de cabra conjugado com HRP contra coelho (P0448) foi comprado da Dako. Nanopartículas de ouro biotinylated (20 nm) foram compradas de Cytodiagnostics. O peptídeo biotinilado com seqüência de aminoácidos KGLPLGNSH foi comprado de Pepscan. O succinimidil 6-(biotinamido)hexanoato (biotin-LC-NHS) foi comprado da ApexBio. Neutravidina, N-hidroxissuccinimida-destiobiotina (EZ-Link NHS-desthiobiotin), 4′,6-diamidino-2-fenilindole (DAPI), e 3,3′-diaminobenzidina (DAB) foram comprados da ThermoFisher Scientific. Sensores pré-ativados para acoplamento de aminas (tipo G easy2spot) foram comprados da Ssens BV. Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), Penicilina e Estreptomicina, e Trypsin-EDTA foram comprados de Gibco. Reporter Lysis Buffer (E397A), reagente de ensaio de luciferase (E1483), e QuantiFluor dsDNA System foram comprados da Promega. As células C2C12-BRE-Luc foram gentilmente cedidas pelo prof. Daniel B. Rifkin.
Neutravidina análise multivalência
Análise espectrofotométrica de HABA foi utilizada para analisar o número de bolsas de ligação de biotina da neutravidina. Especificamente, o HABA pode especificamente ligar-se à (neutr)avidina de forma semelhante à biotina, mas com menor afinidade de ligação. O complexo HABA/neutravidina tem um pico de absorção de cerca de 500 nm. O HABA não ligado tem um pico de absorção de cerca de 350 nm. O deslocamento de HABA por biotina pode assim ser avaliado medindo a absorvância a 350 e 500 nm. Para determinar o número de bolsas de ligação à biotina, a neutravidina foi primeiro incubada com um excesso de HABA, de modo a formar complexos de HABA/neutravidina totalmente saturados. A biotina foi adicionada a estes complexos numa razão neutravidina/biotina molar de 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, e 1:6. Para cada relação neutravidina/biotina, a quantidade tanto do complexo HABA/neutravidina quanto do HABA livre foi determinada pela medição da absorvância a 500 e 350 nm, respectivamente, usando um espectrofotômetro ND1000 (ThermoFisher scientific). O platô a 3,2 biotina/neutravidina indicou o número de bolsas de ligação à biotina, que estava de acordo com a folha de especificações do fabricante (3,1 biotina/neutravidina).
Medições de SPRi
Biotinylated IL-1B foi imobilizado nos sensores easy2spot tipo G usando um spotter de fluxo contínuo (Wasatch Microfluidics). Os sensores do tipo gel foram usados para aumentar a sua capacidade de ligação e para o uso mais eficiente do campo evanescente, em comparação com um sensor de superfície plana. A reação de imobilização foi realizada em tampão ácido acético de 50 mM (150 µl por ponto) com concentrações de anticorpos de 5, 2,5, 1,25, e 0,625 µg ml-1. Como um BSA controle foi detectado a uma concentração de 5 µg/ml. Um tampão de imobilização (pH 4,6) forneceu o acoplamento de anticorpos com a maior actividade retida e, portanto, foi utilizado em todas as experiências. Para reduzir interações não específicas, o sensor foi desativado com 1% (p/v) de BSA em tampão de acetato 50 mM (pH 4,6) por 7 min e posteriormente com etanolamina 0,2 M (pH 8,5) por mais 7 min. O SPRi foi realizado utilizando um sistema MX96 com software de operação SUIT (IBIS). Neutravidina, D-@BMP7, B-@BMP7 e BMP7 foram dissolvidos em tampão de sistema composto por PBS com 0,5% (p/v) BSA e 0,075% (v/v) Tween80 a uma concentração de 250, 100, 100 e 100 nM, respectivamente. A biotina foi dissolvida a uma concentração de 400 µM no tampão do sistema suplementado com 0,1% (v/v) de DMSO. O fluxo de volta e volta foi ajustado para 10 µl min-1 numa célula de fluxo contendo 12 µl de amostra. O software Sprint foi usado para coleta de dados e referenciamento a partir de um total de seis pontos por condição. Os dados foram subsequentemente exportados para Matlab R2015a para análise e controle de qualidade adicionais usando scripts personalizados (disponíveis sob pedido). As constantes de dissociação dos complexos supramoleculares foram determinadas da seguinte forma: primeiro, o sensor foi lavado usando três injecções em branco (i.e., tampão do sistema) para fornecer o fundo para os sinais de interacção. Em seguida, foi utilizada uma abordagem em cascata para determinar a afinidade entre os componentes do complexo. Para isso, o sensor foi incubado com tampão seguido por neutravidina, D-@BMP7 ou B-@BMP7, BMP7, e finalmente solução de biotina. O tempo de associação das interações em cascata foi de 30 min seguidos de 15 min de dissociação. Entre cada injeção, o sensor foi lavado com tampão do sistema. O tempo de associação da interação do deslocamento com a biotina foi de 180 min e foi realizado duas vezes. A cinética pôde ser descrita com uma simples interação 1:1 Langmuir que pode ser capturada com um Eq. exponencial (3).
Nesta equação Rmax é a capacidade de ligação do ligando (RU), kon é a taxa de associação (M-1 s-1), koff é a taxa de dissociação (s-1), c é a concentração do analito (M), e t é o tempo desde o início da interação (s). A constante de dissociação Kd é definida como koff/kon. O software Matlab com scripts personalizados foi usado para analisar os dados de afinidade ajustando-se à interação de Langmuir. Em suma, os espaços em branco foram subtraídos e o sinal foi zerado para a primeira interação. Para determinar a afinidade de uma interação específica, primeiro a taxa de koff foi determinada na fase de dissociação. Em seguida, a taxa kon foi determinada usando um koff fixo. Para o deslocamento com biotina a taxa de koff foi determinada na fase de associação.
Síntese e caracterização Dex-TAB
Dextran foi reagido com cloroformato de p-nitrofenilo (PNC) para formar conjugados de carbonato de p-nitrofenilo, os quais foram então tratados com compostos contendo aminas primárias (Suplemento Fig. 2). Os conjugados de Dextran-p-nitrofenil carbonato (Dex-PNC) foram sintetizados da seguinte forma. Em um experimento típico, o dextran (3,0 g, grupos de 56,3 mmol OH) foi dissolvido em DMF (200 mL, contendo 2,4 g de LiCl) a 90 °C sob uma atmosfera de nitrogênio. Após a dissolução do dextrano, a mistura foi resfriada a 0 °C. Pyridine (1,5 mL, 18,6 mmol) e posteriormente PNC (2,8 g, 13,9 mmol) foram adicionados à solução em pequenas porções enquanto se agitava e mantém a temperatura a 0 °C. A reação foi permitida por uma hora e o produto foi precipitado em etanol frio. O precipitado foi filtrado e lavado com etanol e posteriormente com éter dietílico e, em seguida, seco em estufa a vácuo. A Dextran-tiramina-butilamina (Dex-TA-NH2) foi sintetizada como se segue. A Dex-PNC reagiu primeiro com N-Boc-1,4-diaminobutano e depois com tiramina. O grupo protetor t-butyloxycarbonyl foi removido por reação com TFA. Em um experimento típico, o Dex-PNC28 (1,0 g, 1,36 mmol grupos PNC) foi dissolvido em 16 mL de DMF. O N-Boc-1,4-diaminobutano (0,09 g, 0,48 mmol) foi adicionado sob um fluxo de nitrogênio e a reação foi permitida por 15 min. Em seguida, adicionou-se tiramina (0,20 g, 1,46 mmol) e permitiu que a reação prosseguisse por uma hora. O produto foi precipitado em etanol frio, o precipitado foi filtrado e lavado com etanol e éter dietílico, e depois seco em uma estufa a vácuo. Dex-TA-NH (0,85 g, 0,47 mmol) foi dissolvido em 10 mL de água desionizada. O ácido trifluoroacético (TFA) (1 mL, 13,06 mmol) foi adicionado sob uma atmosfera de nitrogênio e mexido durante a noite. A mistura de reação foi neutralizada por uma solução de NaOH 2 M e purificada por diálise (1000 Da peso molecular cortado) contra uma solução de NaCl 150 mM durante 48 h e água desionizada durante 24 h e depois isolada por liofilização. Dex-TA-NH2 foi ainda funcionalizado com biotina reagindo 2,5 g l-1 Dex-TA-NH2 com um excesso de 20 vezes molar de biotina LC-NHS durante pelo menos 1 h em tampão de bicarbonato 0,1 M (pH 8,5) (Suplemento Fig. 3). O Dex-TAB foi então purificado e concentrado usando uma coluna de filtro spin com corte de 3 kDa de peso molecular. As sínteses bem sucedidas de Dex-PNC, Dex-TA-NH2 e Dex-TAB foram confirmadas usando 1H NMR (AVANCE III HD NanoBay 400 MHz, Bruker) em DMSO-d6 ou D2O. Os números de moieties conjugadas de tiramina e butilamina por 100 anéis de dextran anidroglucose foram determinados calculando as razões dos sinais integrados do dextran (δ 4,0-5,8 ppm) e dos grupos de tiramina (δ 6,66 e δ 6,98 ppm), e os dos grupos de dextran e butilamina (δ 1,4-1,5 ppm), respectivamente. O número de moieties conjugadas de biotina por 100 anéis de anidroglucose dextran foi determinado calculando a razão dos sinais integrados dos grupos de tiramina (δ 6,66 ppm e δ 6,98 ppm) e o espaçador 6-aminocaproico acoplado (δ 2.13).
Dex-TAB crosslinking e pós-funcionamento ortogonal
Dex-TAB construções de hidrogel foram preparadas misturando 5% (p/v) de Dex-TAB, 3 U ml-1 de peroxidase de rábano, e 0,05% (p/v) de H2O2. Para a pós-funcionalização ortogonal, os hidrogéis Dex-TAB foram incubados consecutivamente com 1 µM de neutravidina em tampão de lavagem que consistiu de 1% (p/v) de BSA em PBS, lavados com tampão de lavagem para remover neutravidina não ligada, incubados com 1 µM de molécula biotinilada ou destiobiotinilada de interesse em tampão de lavagem, e lavados novamente com tampão de lavagem para remover moléculas não ligadas. As construções Dex-TAB/neutravidina/destiobiotina poderiam ser expostas subseqüentemente a moléculas biotiniladas de interesse para criar um gradiente bioquímico contra-direcional. Para microscopia de fluorescência (EVOS FL), microscopia confocal de fluorescência (Zeiss LSM 510 e Nikon A1+), e recuperação de fluorescência após fotobleaching (FRAP; Zeiss LSM 510), os microgéis foram funcionalizados diretamente com estreptavidina FITC, ou após a funcionalização da neutravidina como descrito acima, funcionalizados com biotina-atto565, biotina-FITC, e/ou destiobiotina-FITC que foi produzida em casa através do acoplamento da destiobiotina-NHS à 6-aminofluoresceína em tampão bicarbonato 1 M (pH 8). As curvas FRAP foram obtidas plotando-se, em função do tempo, a intensidade fluorescente da mancha de alvejante menos o fundo normalizado para a intensidade média corrigida da taxa de branqueamento antes do branqueamento, onde a taxa de branqueamento foi determinada pela normalização da intensidade fluorescente da amostra além da mancha de branqueamento normalizada para sua intensidade média antes do branqueamento. Para caracterizar o deslocamento da destiobiotina/biotina, as construções de hidrogel Dex-TAB foram funcionalizadas consecutivamente com neutravidina, lavadas com PBS, funcionalizadas com destiobiotina-FITC, lavadas com PBS e funcionalizadas com biotina-atto565, enquanto que as imagens foram feitas com microscopia confocal de fluorescência. Finalmente, os hidrogéis foram cuidadosamente lavados várias vezes com PBS para remover a B-ATTO não ligada e imersa usando a microscopia confocal fluorescente para quantificar a quantidade relativa de D-FITC que tinha sido substituída pela B-ATTO. A experiência foi repetida com outros compostos biotínicos para demonstrar a universalidade da abordagem. Especificamente, os hidrogéis Dex-TAB funcionalizados com neutravidina/D-FITC foram incubados e continuamente monitorados por 8 dias na presença de 1 µM de biotina, peptídeo biotinilado (ou seja, peptídeo B; seqüência de aminoácidos KGLPLGNSH), HRP (B-HRP), imunoglobulina G (B-IgG), ou nanopartículas de ouro (B-GNP) em PBS. As amostras foram cuidadosamente lavadas com PBS durante pelo menos um dia para remover as moléculas não ligadas antes da análise da intensidade D-FITC. A função biológica do B-HRP supramolecularmente complexado foi avaliada usando um kit de coloração DAB seguindo o protocolo do fabricante. Hidrogéis biotinilados em 3D em forma óssea foram criados pela moldagem por injeção de Dex-TAB em um molde de polidimetilsiloxano (PDMS) que foi fabricado usando um master em miniatura em forma óssea. Os ossos de hidrogel foram funcionalizados com FITC de forma homogênea através de incubação noturna posterior com 1 µM de neutravidina, PBS, e 1 µM de soluções D-FITC. Após lavagem completa com PBS, as partes superiores dos hidrogéis em forma de osso foram incubadas com 1 µM B-ATTO usando um revestimento por imersão cronometrado e subsequentemente lavadas com PBS para remover fluoróforos não ligados, e analisadas usando microscopia de fluorescência. Para estudar a estabilidade a longo prazo da complexação supramolecular, dois hidrogéis Dex-TAB de aproximadamente 5 × 5 × 5 mm foram exclusivamente rotulados com D-FITC e B-FITC, cuidadosamente lavados com PBS, e colados covalentemente usando um intermediário de Dex-TA intacto (ou seja, não rotulado) através de reticulação enzimática de moieties de tiramina. As construções combinadas de hidrogel foram então incubadas em PBS e continuamente imersas usando microscopia de fluorescência confocal durante 2 semanas para investigar a estabilidade dos padrões destiobiotinilados e biotinilados. As intensidades de corte transversal de todas as imagens fluorescentes foram determinadas usando o software ImageJ.
Análise da rede de hidrogel
Análise de difusão foi realizada para analisar o efeito das construções de hidrogel Dex-TAB pós-funcionalizante com neutravidina multivalente sobre as propriedades da rede de hidrogel. Para isso, foram combinados com dextran marcados com FITC com raios hidrodinâmicos RH = 2,3 nm (10 kDa), RH = 8,5 nm (150 kDa), e RH = 27 nm (2000 kDa). As construções de hidrogel nas soluções fluorescentes foram então analisadas usando imagens confocais fluorescentes (Zeiss LSM 510) e a intensidade fluorescente dentro e fora das construções foi quantificada usando o software ImageJ. A permeação relativa das moléculas de dextrano marcadas fluorescentemente em Dex-TAB foi determinada normalizando a intensidade com a intensidade fluorescente fora dos hidrogéis. A mesma abordagem foi utilizada para quantificar e comparar a permeabilidade relativa de 5% (p/v) de Dex-TAB para anticorpos IgG convencionais marcados com FITC e VHH.
Modificação e caracterização de VHHH
Destiobiotina conjugada com maleimida foi sintetizada pela reação amino-maleimida e destiobiotina-NHS para 2 h em tampão bicarbonato (pH 8). A destiobiotina-maleimida foi purificada por cromatografia líquida de alta pressão em um Módulo Gradiente Quaternário 2545 (Águas) de 90%/10% Água/Acetonitrilo (0,1% ácido trifluoroacético (TFA)) a 100% Acetonitrilo (0,1% TFA). O produto coletado foi caracterizado com espectrometria de massa; MS(ESI): m/z = 336,96 (calculado m/z = 337,18 para C16H24N4O4). Os solventes foram evaporados com evaporador rotativo a vácuo, após o que a destiobiotina-maleimida foi ressuspendida em água milliQ, congelada em nitrogênio líquido, e liofilizada durante a noite. O VHH destiobiotinilado e biotinilado foram sintetizados por QVQ BV, reagindo a cisteína não modificada do VHH com a destiobiotina conjugada maleimida e a biotina conjugada maleimida, respectivamente. Utilizamos ELISA para avaliar a afinidade contra BMP7 de VHH não modificada versus destiobiotinilada (D-@BMP7) e biotinilada (B-@BMP7). Para este fim, uma placa Maxisorp de 96 poços foi revestida durante a noite a 4 °C com 0,5 µg ml-1 de BMP7 humano em PBS. As placas foram bloqueadas com 4% de leite desnatado em PBS e várias concentrações (0-5 µM) de VHH foram adicionadas em 1% de leite desnatado. A detecção de VHH foi feita usando um anticorpo policlonal de coelho contra VHH e um anticorpo secundário de cabra conjugado com HRP contra coelho. A adição de H2O2 junto com TMB identificou a quantidade de HRP por conversão em um produto colorido. Foi adicionado H2SO4 para parar a reação. As medições espectrofotométricas de absorção foram realizadas a 450 nm utilizando um leitor de placas (Multiscan GO, ThermoFisher Scientific). As curvas dose-resposta foram obtidas ajustando uma função logística aos dados medidos usando Eq. (4).
Cultura de células
C2C12-BRE-Luc células foram cultivadas em meio de cultura composto de 20% (v/v) FBS, 1% (v/v), 100 U/ml de penicilina, e 100 µg/ml de estreptomicina em DMEM. As células foram cultivadas abaixo de 5% de CO2 a 37 °C e o meio de cultura foi substituído 2 vezes por semana. Quando a cultura de células chegou perto da confluência, as células foram separadas usando 0,25% (p/v) Trypsin-EDTA a 37 °C e subsequentemente sub-cultivadas ou usadas para experimentação. A viabilidade das células encapsuladas em enzimaticamente reticulada 5% (p/v) Dex-TAB foi analisada imediatamente após o encapsulamento (ou seja, dia 0) e após quatro e sete dias de cultura in vitro incubando as células durante 30 min com 2 µM de calceína AM (viva) e 4 µM de EthD-1 (morta) em PBS, e visualizando as células rotuladas usando microscopia de fluorescência. A análise ao vivo/morto também foi realizada após a pós-modificação dos hidrogéis Dex-TAB carregados de células com neutravidina, D-@BMP7 e B-@BMP7 usando o mesmo protocolo de funcionalização pós-produção descrito na seção de métodos anteriores “Dex-TAB crosslinking e pós-funcionalização ortogonal”. A actividade metabólica das células foi analisada através da coloração das células usando 0,5 g l-1 MTT em meio de cultura e posterior visualização usando a microscopia de campo brilhante. Para experimentos de indução de BMP7, as células foram semeadas a 10.000 células cm-2 em plástico de cultura de tecidos e cultivadas durante a noite. As células foram esfomeadas usando meio de cultura contendo 0,5% (v/v) de FBS por um período de 12 h. Após a inanição, foram adicionadas à cultura celular construções de Dex-TAB/neutravidina, Dex-TAB/neutravidina/D-@BMP7, Dex-TAB/neutravidina/B-@BMP7, ou Dex-TAB/neutravidina/D-@BMP7 tratadas com biotina, que foram posteriormente expostas a 100 ng ml-1 de BMP7 durante 10 a 15 h (Suplemento Fig. 12). Posteriormente, as células foram lisadas utilizando tampão de lise repórter e um único ciclo de congelamento-descongelamento. A expressão da luciferase foi determinada usando um ensaio de luciferase seguindo o protocolo do fabricante e um luminômetro (Victor X3, Perkin Elmer). A expressão da Luciferase foi normalizada para o conteúdo total de DNA, que foi quantificado usando o Sistema QuantiFluor dsDNA seguindo o protocolo do fabricante e um fluorômetro (Victor X3).
Representação de dados e estatística
Medições espectrofotométricas de absorção de HABA foram realizadas em seis amostras por condição e relatadas como a média ± desvio padrão. As medidas de SPRi foram realizadas em seis pontos por condição e relatadas como média ± desvio padrão (linhas de cor clara). As leituras SPRi de pontos individuais foram normalizadas contra a Rmax das curvas de ligação da neutravidina para corrigir as diferenças na densidade de manchas (Fig. 1 Suplementar). O kon, koff e Kd das interações supramoleculares foram determinados a partir de pelo menos três experimentos SPRi e reportados como a média ± desvio padrão ou sobreposição de datapoints individuais. Medidas FRAP de estreptavidina fluorescentemente marcada foram realizadas em pelo menos quatro construções de hidrogel por condição e relatadas como a média ± desvio padrão normalizada para a intensidade média antes do clareamento. As medidas de intensidade de fluorescência (confocal) (incluindo experimentos com time-lapse) foram realizadas em pelo menos quatro construções de hidrogel por condição e relatadas como a média ± desvio padrão ou sobreposição de datapoints individuais, todas normalizadas para a maior intensidade média. A análise de regressão linear foi realizada utilizando o software OriginPro 2016. O deslocamento de D-FITC por moieties biotinylated foi medido usando microscopia de fluorescência em dez amostras por condição. A significância das diferenças foi estudada usando uma ANOVA unidirecional com o teste post-hoc de Tukey (os dados foram distribuídos normalmente como indicado pelo teste de Shapiro-Wilk: p > 0,1). A permeação das moléculas de dextrano fluorescentes, VHH e IgG em Dex-TAB foi medida em quatro construções de hidrogel por condição e relatada como a média ± desvio padrão. A significância das diferenças entre a permeabilidade de VHH e IgG foi determinada usando um teste Mann-Whitney. A quantificação ao vivo/morto foi realizada em três hidrogéis carregados de células por condição e reportada como a média sobrepondo os pontos de referência individuais. A significância das diferenças foi determinada usando um teste de Kruskal-Wallis ANOVA. As análises de resposta de dose foram realizadas utilizando três amostras por concentração e reportadas como a média ± desvio padrão e uma função logística ajustada de sobreposição baseada em Eq. (4). Os intervalos de confiança das curvas de resposta de dose foram gerados automaticamente pelo software de traçado gráfico. A indução relativa das células C2C12-BRE-Luc foi medida em três amostras in vitro por condição e reportada como a média ± desvio padrão. A significância das diferenças foi determinada usando os testes de Kruskal-Wallis ANOVA.
Esquemática
Todos os gráficos foram feitos usando o software OriginPro 2016. Todos os esquemas foram feitos usando o software ChemDraw Professional 16.0 e o software CorelDRAW X7.
Resumo do relatório
Outras informações sobre o desenho da pesquisa estão disponíveis no Nature Research Reporting Summary ligado a este artigo.