Cultura de células
Rim embrionário humano 293FT (HEK293) células foram cultivadas em DMEM suplementado com 10% de FBS e 1% de penicilina/streptomicina (100 iU por ml; 100 μg por ml). As linhas celulares não foram autenticadas. As células estavam livres de micoplasma. As células foram incubadas em uma atmosfera umidificada de 5% de CO2 a 37 °C. Para linhas celulares estáveis, as células transfectadas foram selecionadas na presença de puroamicina (3 μg por ml). Para estudos de transfecção transitória, as células HEK293 foram semeadas em placas de 6 poços na presença dos vectores, utilizando Lipofectamina2000 (ThermoFisher). Foram estabelecidas linhas de células podocitárias a partir da urina humana42 e foi realizada a genotipagem APOL1, após a obtenção do consentimento informado sob protocolos de pesquisa (94-DK-0127, 94-DK-0133) previamente aprovados pelo NIDDK Institutional Review Board. O caso A é G0/G0 masculino com FSGS, o caso B é G0/G0 masculino com FSGS associado ao HIV, o caso C é G0/G0 masculino com FSGS (HP55-345O-1), o caso D é G1/G2 masculino com FSGS, e o caso E é G1/G2 masculino com FSGS associado ao HIV. As células foram cultivadas em RPMI1640 suplementadas com 10% de FBS, ITS, e 1% de penicilina/streptomicina (100 iU por ml; 100 μg por ml). As células foram incubadas em uma atmosfera umidificada de 5% de CO2 a 33 °C e diferenciadas a 37 °C por 7-10 dias. As linhas celulares não foram autenticadas. As células estavam livres de micoplasma. Antes da coleta dos lisados celulares, as células foram tratadas com 103 U por ml IFNα (Abcam) por 24-72 h e 100 mM de caliculina A (Laboratórios LC) por 30 min. Para experimentos inibitórios de PKR, as células foram tratadas com 1 μM inibidor imidazolo-oxindole PKR C16 (Sigma Aldrich) por 1 h43.
Tecido humano
Tecidos tecidos de biópsia renal humana foram obtidos do Dr. Preeti Chandra, Universidade de Maryland. A pesquisa foi previamente aprovada pelos Conselhos de Revisão Institucional da Universidade de Maryland e NIDDK, NIH.
Informação de Plasmid
O vetor de expressão APOL1 G0 consiste em cDNA humano derivado de CMV APOL1 (NM_001136540: 298-1453). Para APOL1 G1 (rs73885319 A→G e/ou rs60910145 T→G) e G2 (rs71785313 del), foi realizada uma mutagénese dirigida ao local para a sua realização. Para o vetor de expressão APOL1 sem expressão protéica foi produzida pela inserção de um códon de parada e seqüência de frameshift (TAATAGATGA) após o 138º códon. Para o vector de mutação da estrutura secundária, as sequências originais são alteradas por oito alterações sinónimas (NM_001136540: 1195A→T, 1196G→C, 1197C→G, 1203A→T, 1209G→A, 1221G→A, 1224C→G, e 1242T→C). Para o dsRNA estável G0, as sequências originais vectoriais são alteradas por 5 mutações em 3′ UTR (CCA CAG GGC AGG GCA GCC ACC AGG AGA GAT ATG CCT GGC AGG GGC CAG G→CCA CAG GGC AGG CCA GCC ACC AAG AAA GAT ATG CTT GAC AGG GGC CAG G). Para flanquear o RNA em torno dos alelos APOL1 (NM_001136540.1, 1031-1453), pRNAT-CMV3.2/Puro (GeneScript) foi usado como vetor de fundo. Os esquemas de mapas vetoriais estão na Figura Complementar 1.
Immunoblotting
Células foram lisadas em um buffer RIPA contendo inibidor de protease/coquetel inibidor de fosfatase. Os lisados foram separados por eletroforese em gel de poliacrilamida SDS e as proteínas foram submetidas a blotting ocidental e bloqueadas por 30 min em tampão bloqueador Odyssey (LI-COR). Os bloqueios foram incubados com anticorpos primários contra APOL1 (Sigma Aldrich HPA018885), phospho-eIF2α (Cell Signaling Technology #9721), eIF2α (Cell Signaling Technology #5324), β-Actin (Santa Cruz Biotechnology Inc. sc-47778), HRI (Upstate #07-728), phospho-PKR (Santa Cruz Biotechnology Inc. #5324), β-Actin (Santa Cruz Biotechnology Inc. sc-47778), HRI (Upstate #07-728), phospho-PKR (Santa Cruz Biotechnology Inc. #5324). sc-101784), PKR (abcam ab45427), phospho-PERK (Cell Signaling Technology #3179), PERK (Cell Signaling Technology #5683), phospho-GCN (Abcam ab75836), e GCN (Cell Signaling Technology #3302), LC3 (Abcam ab168803) e p62 (Cell signaling #5114). Os bloqueios foram incubados com anticorpos anti-coelho marcados com corante (LI-COR). Todos os blots foram imersos usando o scanner infravermelho Odyssey (LI-COR). As imagens de gel cru são mostradas na Figura Complementar 13.
PCR de transcriptase reversa e PCR quantitativa em tempo real
Células ou rim total foram colhidas em reagente TRIzol e o RNA total foi isolado. O RNA total foi tratado com DNase antes da síntese de cDNA com oligo (dT). Uma alíquota de 5-μg de RNA foi usada para a síntese de cDNA por transcriptase reversa Superscript II. As amostras foram analisadas por PCR (RT) ou RT-PCR quantitativo (qRT-PCR) usando Power SYBR Green PCR master mix (ThermoFisher). A expressão relativa em cada amostra foi calculada como uma razão (gene específico de attamoles por β-actin). Os pares de primers estão listados na Tabela Complementar 1.
Ensaio de síntese de proteínas
Células transformadas HEK293 ou linhas de células de podócitos humanos foram cultivadas em placas de 96 poços e foram tratadas com 103 U por ml IFNα (Abcam) para quantificação ou lâmina de câmara para visualização. O ensaio de síntese (Click-iT AHA Alexa Fluor 488 Protein Synthesis HCS Assay, nº do catálogo. C10289, Invitrogen) foi realizado de acordo com as instruções do fabricante. A contra-mancha nuclear foi realizada com Hoechst. A célula HEK293 sem vetor tratada com 1 puroamicina μM (InvivoGen, San Diego, CA) foi utilizada como controle negativo para este ensaio, com o fundo de ensaio fixado em 0% de intensidade de sinal. Células HEK293 com células vetoriais APOL1 G0 foram definidas como 100% de intensidade de sinal.
Viabilidade celular
Realizaram-se ensaios de viabilidade celular utilizando ensaios ATP. Para quantificar o ATP gerado por células metabolicamente ativas, foi utilizado o ensaio de viabilidade celular CellTiter-Glo luminescente (Promega) de acordo com as instruções do fabricante. As células foram cultivadas em placas estéreis de 96 poços na presença de 103 U por ml IFNα (Abcam) durante 72 h, e então 100 μL de reagente CellTiter-Glo foi adicionado à lise das células. Após uma incubação de 10 min à temperatura ambiente, a luminescência foi detectada utilizando um luminómetro com um tempo de integração de 1 s por poço. Os sinais de luminescência para células foram normalizados pela contagem de células.
Ensaio de velocidade de proliferação celular
Células foram semeadas a 5,0 × 103 células por meio de cultura de 150 µL em cada poço de placa de 96 poços e o inibidor PKR C16 foi adicionado na concentração indicada. Após 0, 24, 48, 50 µL, o número de células foi medido pelo Cell Counting Kit-8 (Sigma-Aldrich).
Níveis de consumo de oxigênio em podócitos humanos cultivados
O analisador de fluxo extracelular XF24 (Seahorse Bioscience, Billerica, MA) foi usado para avaliar as taxas de consumo de oxigênio celular (OCR) de acordo com as instruções da empresa. Em resumo, os podócitos humanos cultivados foram semeados em placas de poço XF24 adquiridas da Seahorse Bioscience, a uma densidade de 2,0 × 104 células por poço (área de superfície 0,33 cm2) em 100 μL meio de cultura e foram incubados durante a noite a 37 °C. No dia seguinte, as células foram tratadas com IFNα (1 × 103 U por ml) com/sem inibidor PKR C16 (100 nM) durante 72 h, seguido de 24 h de tratamento nas placas do poço XF24. Antes das medidas de OCR, a placa experimental XF24 contendo as células foi lavada com meio de ensaio DMEM livre de bicarbonato (Seahorse Bioscience) contendo 25 mM de glicose e 1 mM de piruvato de sódio, e as células foram pré-incubadas por 1 h a 37 °C sem fornecimento de CO2 em 625 μL meio de ensaio. Antes das medições de OCR, o XF24 foi calibrado utilizando um cartucho de calibração de acordo com as instruções da empresa. Após a calibração, as medições de OCR de base foram realizadas na placa de teste durante 4 min.
RNA-imunoprecipitação (RNA-IP)
Células HEK293 estáveis com a variante APOL1-G0, G1, ou G2 foram tratadas com o seguinte (a) 103 U por ml IFNα para 24-72 h e 100 μM ácido palmítico (Sigma) para 2 h, ou (b) 100 mM 103 U por ml IFNα para 24-72 h e caliculina A para 30 min. O ácido palmítico liga diretamente o PKR e inibe a ligação do dsRNA ao PKR44 e, portanto, o ácido palmítico foi utilizado como controle negativo. As células foram irradiadas com luz UV a 200 mJ por cm2. Dez por cento de cada lisado de célula foi guardado para servir como amostra de entrada para RT-qPCR. A imunoprecipitação foi realizada usando o kit de imunoprecipitação de proteína de ligação RNA (EMD Millipore) com base no relatório anterior usando PKR45. O anticorpo Phospho-PKR (Santa Cruz Biotecnologia, sc-101784) ou IgG de coelho de controle foi usado para RNA-IP. O RNA foi extraído com TRIzol, seguido de tratamento com DNase e precipitação de etanol. cDNAs foram gerados usando primers hexamer aleatórios e SuperScript Reverse transcriptase II. As amostras foram analisadas por PCR (RT) ou qRT-PCR usando Power SYBR Green PCR master mix (ThermoFisher). O enriquecimento foi calculado como uma razão (amostra IP por amostra de entrada). Os pares de primers estão listados na Tabela Complementar 1. Nenhum sinal SYBR foi detectado nos controles negativos, células tratadas simuladas com anticorpo fosfo-PKR IP e interferon-α + células tratadas com caliculina A com coelho controle IgG IP
PKR expressão da proteína e purificação
Recombinante PKR foi purificado como previamente relatado46. PKR pPET-PKR/PPase (Addgene #42934) foi transformado em BL21(DE3) Células de Roseta (Novagen). As células foram cultivadas em meio LB a 37 °C até A600 nm ~ 0,7 e a expressão da proteína foi induzida com 1 mM IPTG durante 3 h a ~20 °C. Para a purificação PKR, as células foram ressuspendidas em tampão A (20 mM HEPES (pH 7,5), 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 10 mM β-mercaptoetanol, 10% glicerol) suplementado com coquetel inibidor de protease (Sigma). As células foram lisadas por incubação com 5 mg por ml de lisozima durante 30 min seguidos de sonicação durante 3 min. O lisado foi centrifugado por 20 min. a 20.000g. O sobrenadante foi aplicado a uma coluna de heparina separose (Amersham, Biosciences, Piscataway, NJ) equilibrada em tampão A e a PKR foi eluida usando um gradiente de NaCl. As frações dos picos foram diluídas duas vezes com tampão A e aplicadas em uma coluna de poli(I:C) agarose (Amersham) equilibrada em tampão A. A PKR foi eluuída a 1,1 M de NaCl, concentrada a ~10 mg por ml e armazenada a -80 °C.
ensaio de ativação de PKR
ensaios de ativação de PKR foram realizados como previamente relatado47. A PKR foi desfosforada por λ fosfatase protéica durante 1 h a 30 °C e depois inibida com ortoovanadato de sódio 2 mM. PKR (4 μM) foi incubado com RNA longo (NM_001136540.1, 289-1453: 0,75 μM: 269 ng por ml)/RNA curto (NM_001136540.1, 289-559/560-860/861-1179/1180-1453: 0.1 μM: 8,46 ng por ml)/poly (I:C) 20 μg por ml, 20 mM HEPES (pH 7,5), 4 mM MgCl2, 50 mM KCl, 1,5 mM DTT, e 100 μM ATP (Ambion). As misturas de reação foram incubadas a 30 °C para os tempos indicados e saciadas com tampão de carga SDS 1×. PKR fosforilados foram detectados com anticorpo fosfo-PKR (Santa Cruz Biotechnology, sc-101784).
RNA preparação para experiências de migração de gel e SHAPE
RNAs APOL1 truncados com vários 3′ cassetes de estrutura foram preparados por transcrição in vitro utilizando o kit MegaShortScript (ThermoFisher) de acordo com as recomendações dos fabricantes. Os modelos de transcrição foram gerados em duas reacções PCR semi-nested de plasmídeos contendo alelos APOL1 (G0, G1, G2) ou variantes mutantes dos mesmos (mG0, mG1, mG2). Para a primeira reacção, foram utilizados iniciadores forward e reverse para adicionar um promotor 5′ T7 e um 45 nt 3′ SC, respectivamente, às sequências truncadas de APOL1 (Tabela Complementar 1). Este último elemento é introduzido para fornecer um site de hibridização de transcrição reversa para SHAPE. Uma fração de cada reação foi re-amplificada usando o primer forward original e um primer reverse mais curto para tornar os modelos finais de transcrição mais homogêneos. As reacções de transcrição foram tratadas com Turbo DNase I durante 5 min a 37 °C, incubadas a 85 °C durante 2 min e fraccionadas sobre um gel desnaturante (5% poliacrilamida – 19:1, 1× TBE, 7 M ureia) a temperatura constante (45 °C, 30 W max). Os produtos de RNA desejados foram detectados pela sombra UV, excisados do gel, electroelutados a 200 V durante 2 h a 4 °C, precipitados e armazenados a -20 °C em Tris 10 mM, pH 7,0 antes da utilização. Soluções de RNA foram quantificadas por espectrofotometria.
ensaio de migração do gel
Cada RNA truncado APOL1 foi diluído para 1 μM em 20 μL Tampão de renaturação do RNA (RB; 10 mM Tris (pH 8.0), 100 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 5% glicerol (w por v)), desnaturado por aquecimento a 85 °C durante 2 min e renaturalizado por resfriamento lento (0.1 °C por s) a 25 °C. MgCl2 foi então adicionado a uma concentração final de 0, 1, ou 3 mM e as misturas foram incubadas durante 30 min adicionais a 37 °C para promover a formação de RNA dependente de Mg e/ou outras interações terciárias. Os conformadores de RNA foram estabilizados por resfriamento com flash a 4 °C, após o que foram fracionados sobre um gel de poliacrilamida não desnaturalizado a 5% (acrilamida a 5%, 19:1) durante 16-18 h a 4 °C. Tanto o gel como o tampão de funcionamento continham 1× TBE e 1 mM MgCl2, e os géis foram pré-executados durante ~1 h antes do carregamento. Os géis foram expostos ao corante SybrGreen (ThermoFisher) de acordo com as instruções do fabricante e as posições de migração dos conformadores de RNA detectados usando um gerador de imagens de modo variável Trio+ (GE Healthcare).
SHAPE e geração de modelos estruturais secundários de RNA
SHAPE os métodos experimentais foram descritos anteriormente48,49. Em resumo, o RNA truncado APOL1 com um RNA SC foi dobrado como no ensaio de migração do gel, exceto que o volume da mistura foi de 150 μL, a concentração final de MgCl2 foi de 1 mM e o glicerol foi excluído. As soluções de RNA foram divididas em alíquotas controle (1M7-) e experimental (1M7+) (72 μL cada), e 8 μL DMSO ou 8 μL 30 mM 1M7 em DMSO foi adicionado, respectivamente. Reações de modificação foram incubadas a 37 °C durante 5 min, resfriadas a 4 °C, precipitadas e ressuspendidas de etanol em 10 μL água livre de nucleases. Os RNAs tratados foram transcritos de primers com rótulos diferentes complementares ao cassete de estrutura 3′ (1M7- primer, Cy5.5; 1M7+ primer, Cy5) e hidrolisados por tratamento alcalino. As bibliotecas de cDNA resultantes foram precipitadas com etanol e re-dissolvidas em Solução de Carregamento de Amostras (Genome Lab), depois agrupadas com escadas sequenciais ddA e ddG rotuladas com WellRED D2 (Beckman Coulter) e IRDye 800RS (LI-COR), respectivamente. As amostras combinadas foram fracionadas por eletroforese capilar (CE) usando um Beckman Coulter CEQ 8000 Genetic Analyzer. Para cada RNA, foram gerados perfis de reactividade a partir de electroferogramas CE utilizando o software SHAPEfinder50 e depois introduzidos no software RNAstructure versão 5.751,52 juntamente com as sequências de RNA para gerar modelos estruturais secundários. Parâmetros de inclinação padrão (1,8 kcal por mol) e interceptação (-0,6 kcal por mol) foram utilizados para transformar os valores de reatividade nas restrições de pseudo-energia que modulam o algoritmo de dobramento do RNA. O RNAstructure gera automaticamente múltiplos modelos estruturais que melhor correspondem aos perfis de reatividade derivados de SHAPE e os classifica por energia livre de Gibbs. Os modelos estruturais de menor energia produzidos desta forma são ilustrados na Fig. 3a, b e Suplemento da Fig. 4.
Deitámos abaixo in vitro
Fizemos experiências deitámos abaixo usando linhas de células humanas imortalizadas condicionalmente estabelecidas a partir da urina humana42. Transfectamos estas células com RNAi Negativo Stealth Control Med GC (ThermoFisher) ou com SiRNA furtivo pré-desenhado contra APOL1 (HSS112492, ThermoFisher) utilizando Lipofectamina RNAiMAX (ThermoFisher). BLOCK-iT™ Alexa Fluor Red Fluorescent Oligo foi co-transfectado e utilizado para o controlo da transfecção. As eficiências foram de 52,4-75,4% (níveis de RNA) ou 31,1% (níveis de proteína).
Ratos
Utilizamos ratos transgénicos humanos do gene APOL1 (ratos BAC-APOL1), gerados usando um cromossoma artificial bacteriano que contém o locus para APLOL-G0, ou APOL1-G1, ou APOL1-G2. Um DNA humano de ~47 kb, abrangendo apenas o gene APOL1 com 5′ e 3′ regiões de flanco (incluindo exões 1 e 2 da região APOL2 e 3′ incluindo exões 39-41 de parte do gene MYH9), foi isolado e subclonado do clone BAC humano (ENST00000397278, que corresponde ao NM_003661). Os subclones individuais G0, G1 e G2 BAC foram injetados em embriões 129SvJ/B6N F1 e os fundadores foram posteriormente retrocruzados em 129SvJ. O subclone foi sequenciado para assegurar que era como sequência genómica de referência do NCBI e Ensembl. As únicas diferenças foram os polimorfismos nas regiões intrônicas. Nos experimentos com ratos transgênicos condicionais, utilizamos ratos transgênicos RNA truncados de fundo FVB específicos de podócitos APOL1. Produzimos esses ratos por meio de um sistema transgênico condicional usando nefrina (NPHS1) – seqüência truncada truncada de RNA (NM_001136540, 1031-1453). Nós geramos duas estirpes: NPHS1-APOL1-G0-delta-RNA com rs73885319 A e rs60910145 G e NPHS1-APOL1-G1-delta-RNA com rs73885319 G e rs60910145 G.
Isolamento de glomérulos
Ratos BAC/APOL1 (entre 8 e 12 semanas de idade) foram administrados IFNγ (106 U por kg de peso corporal IP) diariamente durante 3 dias antes da amostragem dos tecidos. O protocolo de isolamento glomerular foi relatado em detalhe53. Em resumo, os ratos foram anestesiados por injeção intraperitoneal de Avertin (2,2,2-tribromoetanol e álcool amílico terciário; 17 μL por g) e perfundidos com 8 × 107 Dynabeads (M450 tosylactivated: Dynal #140.04) diluídos em 20 ml de tampão fosfato salino através do coração. Os rins foram digeridos com colagenase A e DNase I a 37 °C durante 10 min. O tecido digerido com colagenase foi suavemente pressionado através de um filtro de células 100-μm e lavado com HBSS. As amostras foram lavadas e ressuspendidas usando um suporte magnético. Os glomérulos foram coletados e incubados em RPMI1640 suplementados com 10% de FBS, ITS, 1% de penicilina/streptomicina (100 iU por ml; 100 μg por ml) e 100 mM de caliculina A (Laboratórios LC) por 30 min e usados para análise de Western blot.
Immunohistoquímica (amostras de rato)
Ratos BAC/APOL1 (entre 8 e 12 semanas de idade) foram administrados IFNγ (106 U por kg de peso corporal IP) diariamente durante 3 dias. Os ratos são perfundidos com 100 mM de caliculina A contida em PBS antes da amostragem do tecido. Em seguida, os rins foram cortados em pequenos pedaços e incubados em RPMI1640 suplementados com 10% de FBS, ITS, e 100 mM de caliculina A durante 30 min. Em seguida, os tecidos foram imediatamente fixados com formalina tamponada a 10%. Foram administrados ratos BAC/APOL1 (entre 8 e 12 semanas de idade) IFNγ (106 U por kg de peso corporal IP) diariamente durante 3 dias. Foram administrados ratos NPHS1-APOL1-ΔRNA IFNγ (106 U por kg de peso corporal IP) diariamente durante 3 dias antes da amostragem dos tecidos. Usamos parafina fixa 4-5 μm seções de tecido. Os cortes foram desparafinizados/reidratados, a recuperação de antígenos foi feita por aquecimento em meio tampão citrato durante 5 min em um microondas. Os tecidos foram bloqueados por 1% de BSA e 0,1% de saponina. As secções foram incubadas com anticorpos primários, incluindo os seguintes: APOL1 (Sigma Aldrich HPA018885), phospho-PKR (Santa Cruz Biotechnology sc-1656565), phospho-PKR (Santa Cruz Biotechnology Inc. sc-101784), WT1 (Santa Cruz Biotechnology sc-192), e podocalyxin (R&D Systems AF1556). Para imunofluorescência, utilizamos anticorpos secundários do Fluor Alexa (ThermoFisher) e visualizados através de microscopia confocal. Para coloração ABC, foram utilizados anticorpos secundários conjugados com biotina e Avidin-HRP (Vector). Um kit DAB (Vector) foi utilizado para a visualização. Em experimentos com ratos (entre 8 e 12 semanas de idade) foram tratados com IFNγ (106 U por kg de peso corporal IP), injetados por 3 dias antes da amostragem do tecido. Para quantificação do sinal, o sinal de fosfo-PKR do podócito foi detectado por contra-mancha para WT1 em experimentos com camundongos.
Immunohistoquímica (espécimes humanos)
Este estudo foi aprovado previamente pelo IRB na Universidade de Maryland e do NIDDK, NIH. As características básicas dos casos estão listadas na Fig. 5b suplementar. A coloração foi realizada usando 5 seções de tecido fixadas em formol e incluídas em parafina μm. Após a desparafinização, a recuperação do antígeno induzido pelo calor foi realizada por 20 minutos em um tampão de pH 6,0 usando uma panela de pressão (Pascal, Agilent Technologies Dako). As seções foram incubadas com anticorpos primários incluindo os seguintes: phospho-PKR (Santa Cruz Biotechnology sc-1656565) e WT-1 (Santa Cruz Biotechnology sc-192). Foram utilizados anticorpos secundários do Fluor Alexa (ThermoFisher) e visualizados usando microscopia confocal.
Immunohistoquímica e imagens de células vivas
Células foram incubadas com 200 nM de Mito Tracker Green (Invitrogen) e 200 nM de TMRE (Invitrogen) por 20 min antes da detecção do sinal, após 20 μM tratamento com FCCP e visualizadas usando microscopia confocal.
Quantificação de sinais de imagens microscópicas
Para tecido humano, contamos glomérulos sem esclerose global (6 casos de genótipo sem risco: 5, 6, 7, 10, 5, e 9 glomérulos para cada caso, respectivamente; 6 casos de genótipo de risco: 13, 6, 4, 5, 10, e 5 glomérulos, respectivamente). Para tecidos de camundongos e humanos, a potência do laser foi ajustada para que o sinal máximo não fosse saturado. As análises de processamento e colocação de imagens foram realizadas utilizando o software Zen (Carl Zeiss, Oberkochen, Alemanha)54. O coeficiente ponderado de colocalização e a intensidade média em células WT-1 positivas foram calculados como previamente relatado54. Para a intensidade média, padronizamos a intensidade do sinal podocitário utilizando sinais de células intra-glomerulares WT1-negativas para cada glomérulo. Os valores foram escore relativo com intensidade de sinal de APOL1-G0 como 100%. As quantificações foram realizadas de forma cega.
Hibridização in situ
Detecção cromogénica in situ foi realizada em cortes teciduais a partir dos blocos de parafina fixada em formol do rato (FFPE) utilizando o RNAscope in situ hybridization (Advanced Cell Diagnostics, Biotechne, Minneapolis, MN). Em resumo, 5 μm As secções de tecido FFPE foram desparafinizadas, cozidas com reagente pré-tratamento durante 15 min, e depois protease digerida a 40 °C durante 30 min, seguida de hibridação durante 2 h a 40 °C com sonda-Hs-APOL1-01 (Catálogo # 439871, Diagnóstico Celular Avançado). Além disso, Sonda-Mm-PPIB (Catálogo # 313911) e Sonda-DapB (Catálogo # 310043) foram utilizados para controle positivo e negativo, respectivamente. A detecção de locais específicos de ligação da sonda foi visualizada com o RNAScope 2.0 HD Reagent Kit (Brown) (Catálogo # 310035).
Mouse proteinuria modelo
Todos os experimentos foram conduzidos de acordo com o National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals e foram aprovados previamente pelo NIDDK Animal Care and Use Committee (Animal study proposal (K097-KDB-14)). Utilizamos tanto ratos machos como fêmeas, com idades entre 8-15 semanas. Os ratos em cada experimento foram combinados quanto ao sexo, idade e peso corporal. Randomizações foram feitas em relação ao peso corporal. Os tamanhos das amostras para os experimentos foram determinados sem cálculos formais de potência. Os critérios de exclusão foram a perda de peso mais de 20% durante o período experimental. Para indução de proteinúria, ratos (entre 8 e 12 semanas de idade) foram injetados com bFGF e aminonucleósido puro-micina, como descrito anteriormente30. Para a estirpe NPHS1-APOL1-deltaRNA, o aminonucleósido puro-micina (Sigma-Aldrich) foi injetado subcutaneamente no dia 0 (200 mg por kg de peso corporal), e bFGF (Kaken Pharmaceutical) foi injetado por via intravenosa nos dias 0 e 2 (5 μg por animal), respectivamente. Para experimentos com inibidor de PKR, o inibidor de PKR C16 (10 μg por kg de IP) foi injetado diariamente do dia 0 ao dia 1055. Para a linhagem de ratos BAC-APOL1, o interferão γ (Prospec) foi injectado no dia -1 e no dia 1 (106 U por kg de peso corporal), o aminonucleósido puro-micina foi injectado por via subcutânea no dia 0 (300 mg por kg de peso corporal), e o bFGF (Kaken Pharmaceutical) foi injectado por via intravenosa nos dias 0 e 2 (5 μg por animal), respectivamente. Para experimentos com inibidor de PKR, o inibidor de PKR C16 (10 μg por kg de IP) diariamente do dia 0 ao dia 1055.
Medição de albumina urinária e creatinina
Determinamos os níveis de albumina urinária com ELISA usando um kit ELISA de microalbuminúria murina (Exocell). Medimos a concentração de creatinina urinária com o kit de creatinina (Exocell). Todas as medições foram realizadas em duplicado. Determinamos a albumuminúria como a relação entre a albumina urinária e a creatinina. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com os protocolos dos fabricantes. Os investigadores não foram cegos para alocação em grupo, mas foram cegos ao avaliar o resultado.
Análise estatística
Dados de pelo menos três experimentos individuais foram analisados e apresentados como ponto plot e média. Os métodos de análise estatística foram escritos em cada legenda das figuras. Não fizemos ajustes para comparações múltiplas. Valores de P < 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.