Just quando você pensa que encontrou o fixador perfeito para o seu tecido, há algo mais a considerar – o seu fixador pode ter apenas mascarado todos os sítios de antigénios a que o seu adorável novo anticorpo se ia ligar!
Tem apenas mascarado o seu antigéneo?
Como mencionei num dos meus artigos anteriores, a técnica de fixação que escolheu normalmente cria ligações cruzadas dentro das proteínas; esta é uma das formas em que o tecido é estabilizado. Isto pode alterar a bioquímica da proteína de tal forma que o antígeno de interesse é mascarado e não será mais reconhecido pelo seu anticorpo primário.
Não se preocupe – a ajuda está à mão!
O mascaramento do antígeno pode ser causado não só por ligação cruzada dos aminoácidos dentro do epitopo, mas também por ligação cruzada de peptídeos não relacionados dentro ou perto de um epitopo, alterando a conformação de um epitopo, ou alterando a carga electrostática do antígeno. Como o reconhecimento do antígeno-anticorpo depende da estrutura da proteína, é importante tentar restaurar a estrutura natural em 3-D. Não se preocupe – há várias técnicas disponíveis para ultrapassar isto.
Remova a sua máscara!
Alguns anticorpos não requerem qualquer tipo de desmascaramento, mas se o seu requer, não entre em pânico – é apenas um pequeno acréscimo ao seu protocolo habitual. O termo recuperação de antígenos refere-se a qualquer técnica na qual a máscara de um epítopo é invertida e a ligação epítopo-anticorpo é restaurada. O tipo de recuperação de antígeno depende de muitas variáveis que incluem o antígeno alvo, o anticorpo utilizado, o tipo de tecido e o método de fixação utilizado para preservar o seu tecido. Por exemplo, se você estiver usando um anticorpo policlonal, que reconhece múltiplos epitopes, é menos provável que exija a recuperação do antígeno, mas também é provável que ele tenha um pouco mais de fundo. Se você usou uma técnica de fixação como o etanol, então a recuperação do antígeno não é recomendada, pois a fixação pode não ser forte o suficiente para lidar com as condições de recuperação.
Calor ou enzimas – você escolhe
Existem múltiplas técnicas para restaurar a imunoreatividade de um epitopo e estas geralmente se enquadram em duas categorias principais; (a) recuperação de antígenos induzidos por enzimas e (b) recuperação de antígenos induzidos por calor. Além disso, dentro de cada categoria existem várias maneiras diferentes de fazer a recuperação.
Métodos induzidos por enzimas
Nos métodos induzidos por enzimas, enzimas incluindo Proteinase K, Tripsina e Pepsina podem ser usadas para restaurar a ligação de um anticorpo ao seu epitópo. Pensa-se que o mecanismo de acção é a clivagem dos peptídeos que podem estar a mascarar o epitopo. Os principais métodos enzimáticos, que requerem uma incubação de 10-20 minutos a 37?C, são:
- Proteinase K (20 g/ml em tampão TE, pH 8)
- Trypsin (0,5% em dH20)
- Pepsina (0,1% em HCl 10 mM)
- Pronase (0,5 ou 0.1% em dH20)
- Protease (0,5% em dH20)
Dependente do método que você escolher, cada um deve ser otimizado para diferentes tipos de tecidos e anticorpos, mas cada um desses métodos se encaixa antes do bloqueio e após os passos de desparafinação. As desvantagens destes métodos são a baixa taxa de sucesso para restaurar a imunoreatividade e o potencial para destruir tanto a morfologia dos tecidos quanto o antígeno de interesse.
Se você achar a forma induzida pela enzima um pouco dura demais, ou que simplesmente não funciona para você, então você pode tentar o método induzido pelo calor. Acredita-se que este método reverte algumas ligações cruzadas e permite a restauração da estrutura secundária ou terciária do epitópo. É, em essência, uma renaturalização da estrutura das proteínas fixas através de uma série de mudanças conformacionais.
Métodos induzidos por calor
Isso pode incluir a possível hidrólise (quebra) de ligações cruzadas induzidas por formalina com todo o processo sendo impulsionado pela energia térmica da fonte de calor. Como nos métodos induzidos por enzimas, os métodos induzidos por calor requerem otimização. Estes métodos, que requerem 10-40 minutos em um vaporizador, microondas (incrementos de cinco minutos) ou banho-maria a 95-100?C seguido de 20 minutos de resfriamento à temperatura ambiente são:
- Tampão citrato (10 mM Citrato de Sódio, 0,05% Tween 20, pH 6)
- Tampão Citrato-EDTA (10 mM Citrato de Sódio, 2 mM EDTA, 0.05% Tween 20, pH 6,2)
- EDTA (1 mM EDTA, 0,05% Tween 20, pH 8)
- Tris-EDTA (10 mM Tris Base, 1 mM EDTA, 0,05% Tween 20, pH 9)
- EDTA Glicina (50 mM Glicina-HCl, 0.01% EDTA, pH 3,5)
Em geral, os métodos induzidos pelo calor são mais amplamente utilizados, provavelmente porque são mais bem sucedidos. Se você está apenas começando a recuperação de antígenos, então um bom lugar para começar seria o método experimentado e testado de recuperação de tampão citrato. Claro, se não funcionar, então você tem muito para tentar depois.
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