Cultura de celule
Celele de rinichi embrionar uman 293FT (HEK293) au fost cultivate în DMEM suplimentat cu 10% FBS și 1% penicilină/streptomicină (100 iU per ml; 100 μg per ml). Liniile celulare nu au fost autentificate. Celulele erau lipsite de micoplasmă. Celulele au fost incubate într-o atmosferă umidificată cu 5% CO2 la 37 °C. Pentru liniile celulare stabile, celulele transfectate au fost selectate în prezența puromicinei (3 μg pe ml). Pentru studiile de transfecție tranzitorie, celulele HEK293 au fost însămânțate în plăci cu 6 puțuri în prezența vectorilor cu ajutorul Lipofectamin2000 (ThermoFisher). Liniile celulare de podocite au fost stabilite din urină umană42 și s-a efectuat genotiparea APOL1, după ce s-a obținut consimțământul în cunoștință de cauză în cadrul protocoalelor de cercetare (94-DK-0127, 94-DK-0133) aprobate în prealabil de către NIDDK Institutional Review Board. Cazul A este un bărbat G0/G0 cu FSGS, cazul B este un bărbat G0/G0 cu FSGS asociată cu HIV, cazul C este un bărbat G0/G0 cu FSGS (HP55-345O-1), cazul D este un bărbat G1/G2 cu FSGS, iar cazul E este un bărbat G1/G2 cu FSGS asociată cu HIV. Celulele au fost cultivate în RPMI1640 suplimentat cu 10% FBS, ITS și 1% penicilină/streptomicină (100 iU pe ml; 100 μg pe ml). Celulele au fost incubate într-o atmosferă umidificată cu 5% CO2 la 33 °C și au fost diferențiate la 37 °C timp de 7-10 zile. Liniile celulare nu au fost autentificate. Celulele erau lipsite de micoplasmă. Înainte de colectarea lisatelor celulare, celulele au fost tratate cu 103 U per ml IFNα (Abcam) timp de 24-72 h și cu 100 mM calicilină A (LC Laboratories) timp de 30 min. Pentru experimentele de inhibare a PKR, celulele au fost tratate cu 1 μM de inhibitor PKR imidazolo-oxindol imidazolo-oxindol C16 (Sigma Aldrich) timp de 1 h43.
Tesut uman
Tesuturi de biopsie de rinichi uman deidentificat au fost obținute de la Dr. Preeti Chandra, Universitatea din Maryland. Cercetarea a fost aprobată în prealabil de către Consiliile de evaluare instituțională de la Universitatea din Maryland și NIDDK, NIH.
Informații despre plasmidă
Vectoriul de expresie APOL1 G0 constă în ADNc APOL1 uman derivat din promotorul CMV (NM_001136540: 298-1453). Pentru APOL1 G1 (rs73885319 A→G și/sau rs60910145 T→G) și G2 (rs71785313 del), a fost efectuată mutageneza dirijată la fața locului pentru a-l face APOL1 G1 (rs73885319 A→G și/sau rs60910145 T→G) și G2 (rs71785313 del). Pentru vectorul de expresie APOL1 lipsit de expresie proteică a fost produs prin inserarea unui codon de oprire și a unei secvențe frameshift (TAATAGATGA) după codonul 138. Pentru vectorul de mutație a structurii secundare, secvențele originale sunt alterate prin opt modificări sinonime (NM_001136540: 1195A→T, 1196G→C, 1197C→G, 1203A→T, 1209G→A, 1221G→A, 1224C→G și 1242T→C). Pentru vectorul dsRNA G0 stabil, secvențele originale sunt modificate prin 5 mutații în 3′ UTR (CCA CAG GGC AGG GCA GCC ACC AGG AGA GAT ATG CCT GGC AGG GGC CAG GAG→CCA CAG GGC AGG CCA GCC ACC ACC AAG AAA GAT ATG CTT GAC AGG GGC CAG GAG GAG G). Pentru ARN de flancare în jurul alelelor APOL1 (NM_001136540.1, 1031-1453), s-a utilizat pRNAT-CMV3.2/Puro (GeneScript) ca vector de fond. Schemele hărților vectoriale sunt în figura suplimentară 1.
Imunoblotting
Celele au fost lizate într-un tampon RIPA care conține un cocktail de inhibitori de protează/inhibitori de fosfatază. Lizații au fost separați prin electroforeză pe gel de SDS-poliacrilamidă, iar proteinele au fost supuse la Western blotting și blocate timp de 30 de minute în tampon de blocare Odyssey (LI-COR). Blocurile au fost incubate cu anticorpi primari împotriva APOL1 (Sigma Aldrich HPA018885), fosfo-eIF2α (Cell Signaling Technology #9721), eIF2α (Cell Signaling Technology #5324), β-Actin (Santa Cruz Biotechnology Inc. sc-47778), HRI (Upstate #07-728), phospho-PKR (Santa Cruz Biotechnology Inc. sc-101784), PKR (abcam ab45427), phospho-PERK (Cell Signaling Technology #3179), PERK (Cell Signaling Technology #5683), phospho-GCN (Abcam ab75836), și GCN (Cell Signaling Technology #3302), LC3 (Abcam ab168803) și p62 (Cell Signing #5114). Blocurile au fost incubate cu anticorp anti-rabbit marcat cu colorant (LI-COR). Toate blocurile au fost imaginate cu ajutorul scanerului cu infraroșu Odyssey (LI-COR). Imaginile brute ale gelului sunt prezentate în figura suplimentară 13.
Reverse transcriptase PCR și PCR cantitativă în timp real
Celulele sau rinichiul total au fost recoltate în reactiv TRIzol și s-a izolat ARN total. ARN-ul total a fost tratat cu DNază înainte de sinteza ADNc cu oligo (dT). O alicotă de 5 μg de ARN a fost utilizată pentru sinteza ADNc cu transcriptază inversă Superscript II. Probele au fost analizate prin PCR (RT) sau RT-PCR cantitativă (qRT-PCR) utilizând Power SYBR Green PCR master mix (ThermoFisher). Expresia relativă în fiecare probă a fost calculată ca un raport (gena specifică de atomi per β-actina). Perechile de amorsă sunt enumerate în tabelul suplimentar 1.
Test de sinteză a proteinelor
Celele HEK293 transfectate sau liniile celulare de podocite umane au fost cultivate în plăci cu 96 de puțuri și au fost tratate cu 103 U per ml IFNα (Abcam) pentru cuantificare sau cu o lamelă de cameră pentru vizualizare. S-a efectuat testul de sinteză (Click-iT AHA Alexa Fluor 488 Protein Synthesis HCS Assay, catalog nr. C10289, Invitrogen) a fost efectuat conform instrucțiunilor producătorului. Contracolorarea nucleară a fost efectuată cu Hoechst. Celulele HEK293 fără vector tratate cu 1 μM puromicină (InvivoGen, San Diego, CA) au fost utilizate ca martor negativ pentru acest test, cu fundalul setat la o intensitate a semnalului de 0%. Celula HEK293 cu celule cu vector APOL1 G0 a fost setată ca intensitate a semnalului de 100%.
Viabilitatea celulară
Sesizările de viabilitate celulară au fost efectuate cu ajutorul testelor ATP. Pentru a cuantifica ATP generat de celulele metabolic active, am utilizat un test de viabilitate celulară luminescent CellTiter-Glo (Promega) conform instrucțiunilor producătorului. Celulele au fost cultivate în plăci sterile cu 96 de godeuri în prezența a 103 U per ml IFNα (Abcam) timp de 72 de ore, iar apoi s-au adăugat 100 μL de reactiv CellTiter-Glo pentru a liza celulele. După o incubare de 10 minute la temperatura camerei, luminescența a fost detectată cu ajutorul unui luminometru cu un timp de integrare de 1 s pe gode. Semnalele de luminescență pentru celule au fost normalizate în funcție de numărul de celule.
Dezvoltarea vitezei de proliferare celulară
Celele au fost însămânțate la 5,0 × 103 celule pe 150 µL de mediu de cultură în fiecare puț al plăcii cu 96 de puțuri și s-a adăugat inhibitorul PKR C16 la concentrația indicată. După 0, 24, 48, 48, 50 µL, numărul de celule a fost măsurat cu ajutorul Cell Counting Kit-8 (Sigma-Aldrich).
Ratele de consum de oxigen în podocitele umane cultivate
Analizatorul de flux extracelular XF24 (Seahorse Bioscience, Billerica, MA) a fost utilizat pentru a evalua ratele de consum de oxigen celular (OCR) în conformitate cu instrucțiunile companiei. Pe scurt, podocitele umane cultivate au fost însămânțate în plăci cu puțuri XF24 achiziționate de la Seahorse Bioscience, la o densitate de 2,0 × 104 celule pe puț (suprafață de 0,33 cm2) în 100 μL de mediu de cultură și au fost incubate peste noapte la 37 °C. În ziua următoare, celulele au fost tratate cu IFNα (1 × 103 U per ml) cu/fără inhibitorul PKR C16 (100 nM) timp de 72 h, urmat de un tratament de 24 h pe plăcile cu godeuri XF24. Înainte de măsurătorile OCR, placa experimentală XF24 care conținea celulele a fost spălată cu mediu de testare DMEM fără bicarbonat (Seahorse Bioscience) care conține 25 mM de glucoză și 1 mM de piruvat de sodiu, iar celulele au fost preincubate timp de 1 h la 37 °C fără aport de CO2 în 625 μL de mediu de testare. Înainte de măsurătorile OCR, XF24 a fost calibrat cu ajutorul unui cartuș de calibrare în conformitate cu instrucțiunile companiei. După calibrare, măsurătorile OCR de bază au fost efectuate în placa de testare timp de 4 min.
imunoprecipitare ARN (RNA-IP)
Celele HEK293 stabile purtând varianta APOL1-G0, G1 sau G2 au fost tratate prin imitație cu următoarele: (a) 103 U per ml IFNα timp de 24-72 h și 100 μM acid palmitic (Sigma) timp de 2 h sau (b) 100 mM 103 U per ml IFNα timp de 24-72 h și calicilină A timp de 30 min. Acidul palmitic se leagă direct de PKR și inhibă legarea dsRNA la PKR44 și, prin urmare, acidul palmitic a fost utilizat ca martor negativ. Celulele au fost iradiate cu lumină UV la 200 mJ pe cm2. Zece la sută din fiecare lizat celular a fost păstrat pentru a servi ca probă de intrare pentru RT-qPCR. Imunoprecipitarea a fost efectuată cu ajutorul kitului de imunoprecipitare a proteinei de legare a ARN (EMD Millipore) pe baza raportului anterior care utilizează PKR45. Pentru RNA-IP s-a utilizat anticorpul Phospho-PKR (Santa Cruz Biotechnology, sc-101784) sau IgG de iepure de control. ARN-ul a fost extras cu TRIzol, urmat de un tratament cu DNază și precipitare cu etanol. ADNc a fost generat folosind amorse hexamerice aleatoare și SuperScript Reverse transcriptase II. Probele au fost analizate prin PCR (RT) sau qRT-PCR utilizând Power SYBR Green PCR master mix (ThermoFisher). Îmbogățirea a fost calculată ca un raport (eșantion IP per eșantion de intrare). Perechile de primer sunt enumerate în tabelul suplimentar 1. Niciun semnal SYBR nu a fost detectat în controalele negative, în celulele tratate cu mock cu anticorp fosfo-PKR IP și în celulele tratate cu interferon-α + calicilină A cu IgG de iepure de control IP
Expresia și purificarea proteinei PKR
PKR recombinantă a fost purificată așa cum s-a raportat anterior46. PKR pPET-PKR/PPase (Addgene #42934) a fost transformată în celule BL21(DE3) Rosetta (Novagen). Celulele au fost cultivate în mediu LB la 37 °C până când A600 nm ~ 0,7 și expresia proteinei a fost indusă cu 1 mM IPTG timp de 3 h la ~20 °C. Pentru purificarea PKR, celulele au fost resuspendate în tampon A (20 mM HEPES (pH 7,5), 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 10 mM β-mercaptoetanol, 10% glicerol) suplimentat cu un cocktail de inhibitori de protează (Sigma). Celulele au fost lizate prin incubare cu 5 mg per ml de lizozimă timp de 30 de minute, urmată de sonicare timp de 3 minute. Lisatul a fost centrifugat timp de 20 min la 20.000 g. Supernatantul a fost aplicat pe o coloană de heparină Sepharose (Amersham, Biosciences, Piscataway, NJ) echilibrată în tampon A, iar PKR a fost eluat folosind un gradient de NaCl. Fracțiunile de vârf au fost diluate de două ori cu tampon A și aplicate pe o coloană de poli(I:C) agaroză (Amersham) echilibrată în tampon A. PKR a fost eluată la 1,1 M NaCl, concentrată la ~10 mg pe ml și depozitată la -80 °C.
Sesizarea activării PKR
Sesizările de activare PKR au fost efectuate așa cum s-a raportat anterior47. PKR a fost defosforilat de fosfataza λ-proteină timp de 1 h la 30 °C și apoi a fost inhibat cu ortovanadat de sodiu 2 mM. PKR (4 μM) a fost incubat cu ARN lung (NM_001136540.1, 289-1453: 0,75 μM: 269 ng pe ml)/ARN scurt (NM_001136540.1, 289-559/560-860/861-1179/1180-1453: 0.1 μM: 8,46 ng pe ml)/poly (I:C) 20 μg pe ml, 20 mM HEPES (pH 7,5), 4 mM MgCl2, 50 mM KCl, 1,5 mM DTT și 100 μM ATP (Ambion). Amestecurile de reacție au fost incubate la 30 °C pentru timpii indicați și au fost stinse cu tampon de încărcare SDS 1×. PKR-urile fosforilate au fost detectate cu anticorpul fosfo-PKR (Santa Cruz Biotechnology, sc-101784).
Prepararea ARN-ului pentru experimentele de migrare pe gel și SHAPE
ARN-urile APOL1 trunchiate cu diferite casete de structură 3′ au fost pregătite prin transcriere in vitro cu ajutorul kitului MegaShortScript (ThermoFisher) în conformitate cu recomandările producătorului. Șabloanele de transcripție au fost generate în două reacții PCR semi-nested din plasmide care conțin alele APOL1 (G0, G1, G2) sau variante mutante ale acestora (mG0, mG1, mG2). Pentru prima reacție, au fost utilizate amorsă înainte și inversă pentru a adăuga un promotor T7 5′ și, respectiv, un SC 3′ de 45 nt la secvențele APOL1 trunchiate (tabelul suplimentar 1). Ultimul element este introdus pentru a oferi un situs de hibridizare a transcripției inverse pentru SHAPE. O fracțiune din fiecare reacție a fost re-amplificată folosind primerul înainte original și un primer invers mai scurt pentru a face șabloanele finale de transcriere mai omogene. Reacțiile de transcriere au fost tratate cu Turbo DNază I timp de 5 minute la 37 °C, incubate la 85 °C timp de 2 minute și fracționate pe un gel denaturant (5% poliacrilamidă-19:1, 1× TBE, 7 M uree) la temperatură constantă (45 °C, 30 W max). Produsele de ARN dorite au fost detectate prin umbrire UV, separate de gel, electroeluate la 200 V timp de 2 ore la 4 °C, precipitate în etanol și depozitate la -20 °C în Tris 10 mM, pH 7,0 înainte de utilizare. Soluțiile stoc de ARN au fost cuantificate prin spectrofotometrie.
Sensul de migrare pe gel
Care ARN trunchiat APOL1 a fost diluat la 1 μM în 20 μL de tampon de renaturare a ARN (RB; 10 mM Tris (pH 8.0), 100 mM KCl, 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 5% glicerol (w per v)), denaturat prin încălzire la 85 °C timp de 2 min și renaturat prin răcire lentă (0,1 °C pe s) la 25 °C. S-a adăugat apoi MgCl2 la o concentrație finală de 0, 1 sau 3 mM, iar amestecurile au fost incubate încă 30 de minute la 37 °C pentru a promova formarea de interacțiuni Mg-dependente și/sau alte interacțiuni terțiare ale ARN-ului. Conformerii ARN au fost stabilizați prin răcire rapidă la 4 °C, după care au fost fracționați pe un gel de poliacrilamidă nedenaturant de 5% (5% acrilamidă, 19:1) timp de 16-18 ore la 4 °C. Atât gelul, cât și tamponul de rulare conțineau 1× TBE și 1 mM MgCl2, iar gelurile au fost rulate în prealabil timp de ~1 h înainte de încărcare. Gelurile au fost expuse la colorantul SybrGreen (ThermoFisher) în conformitate cu instrucțiunile producătorului, iar pozițiile de migrare ale conformațiilor ARN au fost detectate cu ajutorul unui aparat de imagistică cu mod variabil Typhoon Trio+ (GE Healthcare).
SHAPE și generarea modelelor structurale secundare de ARN
Metodele experimentale SHAPE au fost descrise anterior48,49. Pe scurt, ARN-ul APOL1 trunchiat cu un SC ARN-urile au fost pliate ca în testul de migrare pe gel, cu excepția faptului că volumul amestecului a fost de 150 μL, concentrația finală de MgCl2 a fost de 1 mM și glicerolul a fost exclus. Soluțiile de ARN au fost împărțite în alicote de control (1M7-) și experimentale (1M7+) (72 μL fiecare) și s-au adăugat 8 μL DMSO sau 8 μL 30 mM 1M7 în DMSO, respectiv 8 μL 30 mM7 în DMSO. Reacțiile de modificare au fost incubate la 37 °C timp de 5 minute, răcite la 4 °C, precipitate în etanol și resuspendate în 10 μL de apă fără nucleaze. ARN-urile tratate au fost transcrise invers cu ajutorul unor amorse marcate diferit, complementare casetei de structură 3′ (amorse 1M7-, Cy5,5; amorse 1M7+, Cy5) și hidrolizate prin tratament alcalin. Bibliotecile de ADNc rezultate au fost precipitate cu etanol și redisolvate în soluție de încărcare a probelor (Genome Lab), apoi grupate cu scări de secvențiere ddA și ddG marcate cu WellRED D2 (Beckman Coulter) și, respectiv, IRDye 800RS (LI-COR). Probele combinate au fost fracționate prin electroforeză capilară (CE) cu ajutorul unui analizor genetic Beckman Coulter CEQ 8000. Pentru fiecare ARN, profilele de reactivitate au fost generate din electroferogramele CE cu ajutorul software-ului SHAPEfinder50 și apoi introduse în software-ul RNAstructure versiunea 5.751,52 împreună cu secvențele de ARN pentru a genera modele structurale secundare. Parametrii impliciți de pantă (1,8 kcal pe mol) și de interceptare (-0,6 kcal pe mol) au fost utilizați pentru a transforma valorile reactivității în constrângeri pseudoenergetice care modulează algoritmul de pliere a ARN-ului. RNAstructure generează automat mai multe modele structurale care se potrivesc cel mai bine cu profilurile de reactivitate derivate din SHAPE și le clasifică în funcție de energia liberă Gibbs. Modelele structurale cu cea mai joasă energie produse în acest mod sunt ilustrate în Fig. 3a, b și în Fig. 4 suplimentară.
In vitro knock down
Am efectuat experimente de knock down folosind linii celulare umane imortalizate condiționat stabilite din urină umană42. Am transfectat aceste celule fie cu Stealth RNAi Negative Control Med GC (ThermoFisher), fie cu un siRNA stealth predestinat împotriva APOL1 (HSS112492, ThermoFisher) folosind Lipofectamine RNAiMAX (ThermoFisher). BLOCK-iT™ Alexa Fluor Red Fluorescent Oligo a fost co-transfectat și utilizat pentru controlul transfecției. Eficiențele de knock down au fost de 52,4-75,4% (niveluri de ARN) sau 31,1% (niveluri de proteine).
Șoareci
Am folosit șoareci transgenici cu locusul genei umane APOL1 (șoareci BAC-APOL1), generați folosind un cromozom artificial bacterian care conține locusul pentru APLOL-G0, sau APOL1-G1, sau APOL1-G2. Un ADN uman de ~47 kb, care cuprinde doar gena APOL1 cu regiunile de flancare 5′ și 3′ (inclusiv exonii 1 și 2 ai APOL2 și regiunea 3′ care include exonii 39-41 ai unei părți din gena MYH9), a fost izolat și subclonat din clona BAC uman (ENST00000397278, care corespunde NM_003661). Subclonele BAC individuale G0, G1 și G2 au fost injectate în embrioni 129SvJ/B6N F1, iar fondatorii au fost ulterior reîncrucișați cu 129SvJ. Subclonul a fost secvențiat pentru a se asigura că este ca secvență genomică de referință din NCBI și Ensembl. Singurele diferențe au fost polimorfismele din regiunile intronice. În experimentele cu șoareci transgenici condiționați, am utilizat șoareci transgenici cu ARN trunchiat APOL1 specific podocitelor din fondul FVB. Am produs acești șoareci prin intermediul unui sistem transgenic condiționat folosind o secvență de ARN trunchiat (NM_001136540, 1031-1453) condusă de promotor al nefrinei (NPHS1). Am generat două tulpini: NPHS1-APOL1-G0-delta-RNA cu rs73885319 A și rs60910145 G și NPHS1-APOL1-G1-delta-RNA cu rs73885319 G și rs60910145 G.
Isolarea glomerulilor
Soarecilor BAC/APOL1 (cu vârsta cuprinsă între 8 și 12 săptămâni) li s-a administrat IFNγ (106 U per kg greutate corporală IP) zilnic timp de 3 zile înainte de prelevarea de probe de țesut. Protocolul de izolare glomerulară a fost raportat în detaliu53. Pe scurt, șoarecii au fost anesteziați printr-o injecție intraperitoneală de Avertin (2,2,2-tribromoetil și alcool amilic terțiar; 17 μL per g) și au fost perfuzați cu 8 × 107 Dynabeads (M450 tosilactivat: Dynal #140.04) diluate în 20 ml de soluție salină tamponată cu fosfat prin inimă. Rinichii au fost digerați cu colagenază A și DNază I la 37 °C timp de 10 min. Țesutul digerat cu colagenază a fost presat ușor printr-un filtru celular de 100 μm și spălat cu HBSS. Probele au fost spălate și resuspendate cu ajutorul unui suport magnetic. Glomerulii au fost colectați și incubați în RPMI1640 suplimentat cu 10% FBS, ITS, 1% penicilină/streptomicină (100 iU per ml; 100 μg per ml) și 100 mM caliculină A (LC Laboratories) timp de 30 min și au fost utilizați pentru analiza Western blot.
Imunohistochimie (specimene de șoareci)
Șoarecilor BAC/APOL1 (cu vârsta cuprinsă între 8 și 12 săptămâni) li s-a administrat IFNγ (106 U per kg greutate corporală IP) zilnic timp de 3 zile. Șoarecii sunt perfuzați cu 100 mM de calicilină A conținută în PBS înainte de prelevarea țesuturilor. Apoi, rinichii au fost tăiați în bucăți mici și incubați în RPMI1640 suplimentat cu 10% FBS, ITS și 100 mM calicula A timp de 30 min. Apoi, țesuturile au fost fixate imediat cu 10% formalină tamponată. Șoarecilor BAC/APOL1 (cu vârsta cuprinsă între 8 și 12 săptămâni) li s-a administrat IFNγ (106 U pe kg de greutate corporală IP) zilnic timp de 3 zile. Șoarecilor NPHS1-APOL1-ΔRNA li s-a administrat IFNγ (106 U per kg greutate corporală IP) zilnic timp de 3 zile înainte de prelevarea țesuturilor. Am utilizat secțiuni de țesut de 4-5 μm fixate în parafină. Secțiunile au fost deparafinate/rehidratate, iar recuperarea antigenului a fost realizată prin încălzire în mediu tamponat cu citrat timp de 5 minute în cuptorul cu microunde. Țesuturile au fost blocate cu 1% BSA și 0,1% saponină. Secțiunile au fost incubate cu anticorpi primari, inclusiv cu următorii: APOL1 (Sigma Aldrich HPA018885), phospho-PKR (Santa Cruz Biotechnology sc-1656565), phospho-PKR (Santa Cruz Biotechnology Inc. sc-101784), WT1 (Santa Cruz Biotechnology sc-192) și podocalyxin (R&D Systems AF1556). Pentru imunofluorescență, am utilizat anticorpi secundari Alexa Fluor (ThermoFisher) și am vizualizat cu ajutorul microscopiei confocale. Pentru colorația ABC, s-au folosit anticorpi secundari conjugați cu biotină și Avidină-HRP (Vector). Pentru vizualizare s-a utilizat un kit DAB (Vector). În experimentele pe șoareci, șoarecii (cu vârste cuprinse între 8 și 12 săptămâni) au fost tratați cu IFNγ (106 U per kg greutate corporală IP), injectat timp de 3 zile înainte de prelevarea țesuturilor. Pentru cuantificarea semnalului, semnalul fosfo-PKR al podocitelor a fost detectat prin contracolorare pentru WT1 în experimentele cu șoareci.
Imunohistochimie (specimene umane)
Acest studiu a fost aprobat în prealabil de IRB la Universitatea din Maryland și de NIDDK, NIH. Caracteristicile de bază ale cazurilor sunt enumerate în figura suplimentară 5b. Colorația a fost efectuată utilizând secțiuni de țesut de 5 μm grosime, fixate în formol și încorporate în parafină. După deparafinare, recuperarea antigenului indusă de căldură a fost efectuată timp de 20 de minute într-un tampon cu pH 6,0 cu ajutorul unui aparat de gătit sub presiune (Pascal, Agilent Technologies Dako). Secțiunile au fost incubate cu anticorpi primari, inclusiv cu următorii: fosfo-PKR (Santa Cruz Biotechnology sc-1656565) și WT-1 (Santa Cruz Biotechnology sc-192). Am folosit anticorpi secundari Alexa Fluor (ThermoFisher) și am vizualizat cu ajutorul microscopiei confocale.
Imunohistochimie și imagistică cu celule vii
Celele au fost incubate cu 200 nM de Mito Tracker Green (Invitrogen) și 200 nM de TMRE (Invitrogen) timp de 20 min înainte de detectarea semnalului, după tratamentul cu 20 μM FCCP și vizualizate cu ajutorul microscopiei confocale.
Cuantificarea semnalului din imaginile microscopice
Pentru țesutul uman, am numărat glomeruli fără scleroză globală (6 cazuri de genotip fără risc: 5, 6, 6, 7, 10, 5 și, respectiv, 9 glomeruli pentru fiecare caz; 6 cazuri cu genotip de risc: 13, 6, 4, 5, 5, 10 și, respectiv, 5 glomeruli). Pentru țesuturile umane și de șoarece, puterea laserului a fost ajustată astfel încât semnalul maxim să nu fie saturat. Prelucrarea imaginilor și analizele de colocalizare au fost efectuate cu ajutorul software-ului Zen (Carl Zeiss, Oberkochen, Germania)54. Coeficientul ponderat de colocalizare și intensitatea medie în celulele WT-1 pozitive au fost calculate așa cum s-a raportat anterior54. Pentru intensitatea medie, am standardizat intensitatea semnalului podocitelor folosind semnale din celulele intra-glomerulare WT1-negative pentru fiecare glomerul. Valorile au fost scoruri relative cu intensitatea semnalului APOL1-G0 ca 100%. Cuantificările au fost efectuate în orb.
Hibridizare in situ
Detecția cromogenică in situ a fost efectuată pe secțiuni de țesut din blocuri de șoarece fixate în formol și încorporate în parafină (FFPE) utilizând hibridizarea in situ RNAscope (Advanced Cell Diagnostics, Biotechne, Minneapolis, MN). Pe scurt, secțiunile de țesut FFPE de 5 μm au fost deparafinate, fierte cu un reactiv de pretratare timp de 15 min, apoi digerate cu protează la 40 °C timp de 30 min, urmate de hibridizare timp de 2 h la 40 °C cu sonda-Hs-APOL1-01 (nr. de catalog 439871, Advanced Cell Diagnostics). În plus, sonda-Mm-PPIB (nr. de catalog 313911) și sonda-DapB (nr. de catalog 310043) au fost utilizate pentru controlul pozitiv și, respectiv, negativ. Detectarea situsurilor specifice de legare a sondei a fost vizualizată cu RNAScope 2.0 HD Reagent Kit (Brown) (Catalog # 310035).
Model de proteinurie de șoarece
Toate experimentele au fost efectuate în conformitate cu Ghidul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator al National Institutes of Health și au fost aprobate în prealabil de către Comitetul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor NIDDK (propunerea de studiu pe animale (K097-KDB-14)). Am folosit atât șoareci masculi, cât și femele, cu vârsta cuprinsă între 8-15 săptămâni. Șoarecii din fiecare experiment au fost potriviți în ceea ce privește sexul, vârsta și greutatea corporală. Au fost efectuate randomizări în ceea ce privește greutatea corporală. Dimensiunile eșantioanelor pentru experimente au fost determinate fără calcule formale de putere. Criteriile de excludere au fost pierderea în greutate mai mare de 20% în timpul perioadei experimentale. Pentru inducerea proteinuriei, șoarecii (cu vârsta cuprinsă între 8 și 12 săptămâni) au fost injectați cu bFGF și puromicină aminonucleozidă, așa cum s-a descris anterior30. Pentru tulpina de șoareci NPHS1-APOL1-deltaRNA, puromicină aminonucleozidă (Sigma-Aldrich) a fost injectată subcutanat în ziua 0 (200 mg pe kg de greutate corporală), iar bFGF (Kaken Pharmaceutical) a fost injectat intravenos în zilele 0 și, respectiv, 2 (5 μg per animal). Pentru experimentele cu inhibitori PKR, s-a folosit inhibitorul PKR C16 (10 μg per kg IP) zilnic din ziua 0 până în ziua 1055. Pentru tulpina de șoareci BAC-APOL1, interferonul γ (Prospec) a fost injectat în ziua -1 și în ziua 1 (106 U pe kg de greutate corporală), puromicină aminonucleozidă a fost injectată subcutanat în ziua 0 (300 mg pe kg de greutate corporală), iar bFGF (Kaken Pharmaceutical) a fost injectat intravenos în zilele 0 și, respectiv, 2 (5 μg pe animal). Pentru experimentele cu inhibitor PKR, s-a folosit inhibitorul PKR C16 (10 μg per kg IP) zilnic din ziua 0 până în ziua 1055.
Măsurarea albuminei și creatininei urinare
Am determinat nivelurile de albumină urinară cu ELISA folosind un kit ELISA pentru microalbuminurie murină (Exocell). Am măsurat concentrația de creatinină din urină cu un kit de creatinină (Exocell). Toate măsurătorile au fost efectuate în dublu exemplar. Am determinat albuminuria ca fiind raportul dintre albumina urinară și creatinină. Toate procedurile au fost efectuate în conformitate cu protocoalele producătorilor. Investigatorii nu au fost orbiți în ceea ce privește alocarea grupului, dar au fost orbiți atunci când au evaluat rezultatele.
Analiză statistică
Datele din cel puțin trei experimente individuale au fost analizate și prezentate sub formă de dot plot și medie. Metodele de analiză statistică au fost scrise în legendele fiecărei figuri. Nu am ajustat pentru comparații multiple. Valorile de P < 0,05 au fost considerate semnificative din punct de vedere statistic.