Materiale
Acidul 4′-hidroxiazobenzen-2-carboxilic (HABA), biotină, sare de trifluoroacetat de N-(2-aminoetil)maleimidă (amino-maleimidă), acid acetic, acetat de sodiu, acid fosforic, clorură de magneziu, Tween 20, Tween 80, seroalbumină bovină (BSA), dimetilsulfoxid (DMSO), dextran (Dex; MW 15-25 kg mol-1-Mn 16 kg/mol; liofilizat înainte de utilizare), cloroformat de 4-nitrofenil (PNC; sublimat înainte de utilizare), LiCl (uscat la 110 °C înainte de utilizare), tiramină (TA), piridină anhidră, N,N-dimetilformamidă (DMF) anhidră, N,N-Diizopropiletilamidă (DIPEA), piperidină, aminoacizi, anhidridă acetică, triisopropilsilan, acid trifluoroacetic (TFA), hidroxid de sodiu (NaOH), N-Boc-1,4-butandiamină (NH2-Boc), bicarbonat de sodiu (NaHCO3), biotină-atto565, biotină-4-fluoresceină (biotin-FITC), 6-aminofluoresceină, peroxidază de hrean (HRP, tip VI), biotină-HRP, peroxid de hidrogen (H2O2); cu inhibitor), ser fetal bovin (FBS), calceină AM, homodimer-1 de etidiu (EthD-1), albastru de tiazolil albastru de tetrazoliu (MTT) și toți ceilalți solvenți, cu excepția cazului în care se specifică altfel, au fost achiziționați de la Sigma-Aldrich. Masterul în formă de os a fost achiziționat de la LEGO. Polidimetilsiloxanul (PDMS; Sylgard 184) a fost achiziționat de la Dow Corning. Soluția salină tamponată cu fosfat (PBS) a fost achiziționată de la Lonza. BMP7 uman recombinant (354-BP-010), 3,3′,5,5′-tetrametilbenzidină (TMB) și H2SO4 au fost achiziționate de la R&D Systems. Rășina Fmoc-Rink 4-metilbenzhidrilamină (MBHA) (scară de 50 mg, substituție 0,52 mmol g-1) și hexafluorofosfat de N,N,N′,N′-Tetrametil-O-(1H-benzotriazol-1-il)uroniu (HBTU) au fost achiziționate de la MultiSynTech. Cloroformul și 1-metil-2-pirrolidinona (NMP) au fost achiziționate de la WR Chemicals. Anticorpul VHH împotriva BMP7 (Q32c-lab, clona G7) și anticorpul policlonal de iepure împotriva VHH (K1216) au fost achiziționate de la QVQ. Anticorpul IL-1β biotinilat (508301, clona JK1B2, RRID:AB_315512) a fost achiziționat de la Biolegend. IgG biotinilat (Biotin-SP AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG; 711-065-152) a fost achiziționat de la Jackson Immunoresearch. Anticorpul secundar de capră de iepure conjugat cu HRP (P0448) a fost achiziționat de la Dako. Nanoparticulele de aur biotinilate (20 nm) au fost achiziționate de la Cytodiagnostics. Peptida biotinilată cu secvența de aminoacizi KGLPLGNSH a fost achiziționată de la Pepscan. Succinimidil 6-(biotinamido)hexanoat (biotin-LC-NHS) a fost achiziționat de la ApexBio. Neutravidina, N-hidroxizuccinimida-desthiobiotină (EZ-Link NHS-desthiobiotină), 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) și kitul de colorare cu 3,3′-diaminobenzidină (DAB) au fost achiziționate de la ThermoFisher Scientific. Senzorii pre-activați pentru cuplarea aminei (easy2spot de tip G) au fost achiziționați de la Ssens BV. Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), penicilină și streptomicină și tripsină-EDTA au fost achiziționate de la Gibco. Reporter Lysis Buffer (E397A), reactivul de testare a luciferazei (E1483) și sistemul QuantiFluor dsDNA au fost achiziționate de la Promega. Celulele C2C12-BRE-Luc au fost oferite cu amabilitate de către prof. Daniel B. Rifkin.
Analiză de multivalență a neutravidinei
Analiza spectrofotometrică a HABA a fost utilizată pentru a analiza numărul de buzunare de legare la biotină ale neutravidinei. Mai exact, HABA se poate lega în mod specific de (neutr)avidină în mod similar cu biotina, dar cu o afinitate de legare mai mică. Complexul HABA/neutravidină are un vârf de absorbție în jurul valorii de 500 nm. HABA nelegat are un vârf de absorbție în jurul valorii de 350 nm. Prin urmare, deplasarea HABA de către biotină poate fi evaluată prin măsurarea absorbției la 350 și 500 nm. Pentru a determina numărul de buzunare de legare de biotină a neutravidinei, aceasta a fost mai întâi incubată cu un exces de HABA, astfel încât să se formeze complexe HABA/neutravidină complet saturate. Biotina a fost adăugată la acești complecși într-un raport molar neutravidină/biotină de 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5 și 1:6. Pentru fiecare raport neutravidină/biotină, cantitatea atât a complexului HABA/neutravidină, cât și a HABA liber a fost determinată prin măsurarea absorbanței la 500 și, respectiv, 350 nm, cu ajutorul unui spectrofotometru ND1000 (ThermoFisher scientific). Platoul la 3,2 biotină/neutravidină a indicat numărul de buzunare de legare a biotinei, care a fost în conformitate cu fișa de specificații a producătorului (3,1 biotină/neutravidină).
Măsurătorile SPRi
IL-1B biotinilată a fost imobilizată pe senzori easy2spot de tip G cu ajutorul unui spotter cu flux continuu (Wasatch Microfluidics). Senzorii de tip gel au fost utilizați pentru capacitatea lor de legare mai mare și pentru utilizarea mai eficientă a câmpului evanescent, în comparație cu un senzor cu suprafață plană. Reacția de imobilizare a fost realizată în tampon de acid acetic 50 mM (150 µl per spot) cu concentrații de anticorpi de 5, 2,5, 1,25 și 0,625 µg ml-1. Ca martor, s-a pus BSA la o concentrație de 5 µg/ml. Un tampon de imobilizare (pH 4,6) a asigurat o cuplare a anticorpilor cu cea mai mare activitate reținută și, prin urmare, a fost utilizat pentru toate experimentele. Pentru a reduce interacțiunile nespecifice, senzorul a fost dezactivat cu 1% (p/v) BSA în tampon de acetat 50 mM (pH 4,6) timp de 7 minute și, ulterior, cu etanolamină 0,2 M (pH 8,5) timp de încă 7 minute. SPRi a fost realizată cu ajutorul unui sistem MX96 cu software-ul de operare SUIT (IBIS). Neutravidina, D-@BMP7, B-@BMP7 și BMP7 au fost dizolvate în tamponul sistemului format din PBS cu 0,5 % (w/v) BSA și 0,075 % (v/v) Tween80 la o concentrație de 250, 100, 100 și, respectiv, 100 nM. Biotina a fost dizolvată la o concentrație de 400 µM în tampon de sistem suplimentat cu 0,1% (v/v) DMSO. Fluxul dus-întors a fost setat la 10 µl min-1 într-o celulă de flux care conținea 12 µl de probă. Software-ul Sprint a fost utilizat pentru colectarea datelor și referințe de la un total de șase spoturi pentru fiecare condiție. Datele au fost ulterior exportate în Matlab R2015a pentru o analiză suplimentară și controlul calității utilizând scripturi personalizate (disponibile la cerere). Constantele de disociere ale complecșilor supramoleculari au fost determinate după cum urmează: mai întâi, senzorul a fost spălat folosind trei injecții în alb (de exemplu, tamponul sistemului) pentru a asigura fundalul pentru semnalele de interacțiune. Apoi, s-a utilizat o abordare în cascadă pentru a determina afinitatea dintre componentele complexului. În acest scop, senzorul a fost incubat cu tampon, urmat de neutravidină, D-@BMP7 sau B-@BMP7, BMP7 și, în final, soluție de biotină. Timpul de asociere a interacțiunilor în cascadă a fost de 30 de minute, urmat de 15 minute de disociere. Între fiecare injecție, senzorul a fost spălat cu tampon de sistem. Timpul de asociere al interacțiunii de dislocare cu biotina a fost de 180 min și a fost efectuat de două ori. Cinetica a putut fi descrisă cu o interacțiune Langmuir 1:1 simplă, care poate fi captată cu o ecuație exponențială (3).
În această ecuație Rmax este capacitatea de legare a ligandului (RU), kon este viteza de asociere (M-1 s-1), koff este viteza de disociere (s-1), c este concentrația analitului (M), iar t este timpul de la începutul interacțiunii (s). Constanta de disociere Kd se definește ca fiind koff/kon. Software-ul Matlab cu scripturi personalizate a fost utilizat pentru a analiza datele de afinitate prin adaptarea interacțiunii Langmuir. Pe scurt, blanchetele au fost sustrase și semnalul a fost redus la zero la prima interacțiune. Pentru a determina afinitatea unei anumite interacțiuni, mai întâi s-a determinat rata koff în faza de disociere. Ulterior, s-a determinat rata kon folosind un koff fix. Pentru deplasarea cu biotina, rata koff a fost determinată în faza de asociere.
Sinteza și caracterizarea de Dex-TAB
Dextranul a reacționat cu cloroformatul de p-nitrofenil (PNC) pentru a forma conjugați de carbonat de p-nitrofenil, care au fost apoi tratați cu compuși care conțin amine primare (figura suplimentară 2). Conjugatele dextran-p-nitrofenil carbonat (Dex-PNC) au fost sintetizate după cum urmează. Într-un experiment tipic, dextranul (3,0 g, 56,3 mmol de grupări OH) a fost dizolvat în DMF (200 ml, conținând 2,4 g de LiCl) la 90 °C sub o atmosferă de azot. După ce dextranul a fost dizolvat, amestecul a fost răcit la 0 °C. Piridina (1,5 mL, 18,6 mmol) și, ulterior, PNC (2,8 g, 13,9 mmol) au fost adăugate la soluție în porții mici, în timp ce se agită și se menține temperatura la 0 °C. Reacția a fost lăsată să continue timp de o oră, iar produsul a fost precipitat în etanol rece. Precipitatul a fost filtrat și spălat cu etanol și apoi cu eter dietilic, după care a fost uscat într-un cuptor cu vid. Dextran-tiramina-butilamină (Dex-TA-NH2) a fost sintetizată după cum urmează. Dex-PNC a reacționat mai întâi cu N-Boc-1,4-diaminobutan și apoi cu tiramină. Grupa protectoare t-butiloxicarbonil a fost îndepărtată prin reacție cu TFA. Într-un experiment tipic, Dex-PNC28 (1,0 g, 1,36 mmol grupuri PNC) a fost dizolvat în 16 ml de DMF. S-a adăugat N-Boc-1,4-diaminobutan (0,09 g, 0,48 mmol) sub un flux de azot și s-a lăsat reacția să se desfășoare timp de 15 min. Ulterior, s-a adăugat tiramina (0,20 g, 1,46 mmol) și s-a lăsat reacția să continue timp de o oră. Produsul a fost precipitat în etanol rece, precipitatul a fost filtrat și spălat cu etanol și eter dietilic, apoi a fost uscat într-un cuptor cu vid. Dex-TA-NH protejat cu Boc (0,85 g, 0,47 mmol) a fost dizolvat în 10 ml de apă deionizată. S-a adăugat acid trifluoroacetic (TFA) (1 mL, 13,06 mmol) sub atmosferă de azot și s-a agitat peste noapte. Amestecul de reacție a fost neutralizat cu o soluție de NaOH 2 M și purificat prin dializă (limită de greutate moleculară de 1000 Da) față de o soluție de NaCl 150 mM timp de 48 h și apă deionizată timp de 24 h și apoi izolat prin liofilizare. Dex-TA-NH2 a fost funcționalizat în continuare cu biotină prin reacția a 2,5 g l-1 Dex-TA-NH2 cu un exces molar de 20 de ori mai mare de biotină-LC-NHS timp de cel puțin 1 h în soluție tampon de bicarbonat 0,1 M (pH 8,5) (figura suplimentară 3). Dex-TAB a fost apoi purificat și concentrat cu ajutorul unei coloane cu filtru de centrifugare cu o limită de greutate moleculară de 3 kDa. Sintezele reușite de Dex-PNC, Dex-TA-NH2 și Dex-TAB au fost confirmate cu ajutorul 1H RMN (AVANCE III HD NanoBay 400 MHz, Bruker) în DMSO-d6 sau D2O. Numărul de fracțiuni de tiramină și butilamină conjugate la 100 de inele de anhidroglucoză de dextran a fost determinat prin calcularea rapoartelor dintre semnalele integrate ale dextranului (δ 4,0-5,8 ppm) și ale grupărilor de tiramină (δ 6,66 și δ 6,98 ppm) și, respectiv, cele ale dextranului și ale grupărilor de butilamină (δ 1,4-1,5 ppm). Numărul de fracțiuni de biotină conjugate la 100 de inele de anhidroglucoză de dextran a fost determinat prin calcularea raportului dintre semnalele integrate ale grupărilor tiramină (δ 6,66 ppm și δ 6,98 ppm) și ale distanțierului 6-aminocaproic cuplat (δ 2.13).
Reticularea Dex-TAB și post-funcționalizarea ortogonală
Construcțiile hidrogelului Dex-TAB au fost preparate prin amestecarea a 5% (p/v) Dex-TAB, 3 U ml-1 peroxidază de hrean și 0,05% (p/v) H2O2. Pentru postfuncționalizarea ortogonală, hidrogelurile Dex-TAB au fost incubate consecutiv cu 1 µM neutravidină în tampon de spălare care a constat din 1% (p/v) BSA în PBS, spălate cu tampon de spălare pentru a elimina neutravidina nelegată, incubate cu 1 µM de moleculă de interes biotinilată sau destiobiotinilată în tampon de spălare și spălate din nou cu tampon de spălare pentru a elimina moleculele nelegate. Construcțiile Dex-TAB/neutravidină/desthiobiotină pot fi ulterior expuse la molecule biotinilate de interes pentru a crea un gradient biochimic contradirecțional. Pentru microscopia de fluorescență (EVOS FL), microscopia confocală de fluorescență (Zeiss LSM 510 și Nikon A1+) și recuperarea fluorescenței după fotoblânare (FRAP; Zeiss LSM 510), microgelurile au fost funcționalizate direct cu streptavidină-FITC sau, după funcționalizarea cu neutravidină conform descrierii de mai sus, au fost funcționalizate cu biotină-atto565, biotină-FITC și/sau desthiobiotină-FITC care a fost produsă în casă prin cuplarea desthiobiotină-NHS cu 6-aminofluoresceină în tampon bicarbonat 1 M (pH 8). Curbele FRAP au fost obținute prin reprezentarea grafică, în funcție de timp, a intensității fluorescente a spotului de albire minus fondul normalizat pentru intensitatea medie corectată în funcție de rata de albire înainte de albire, unde rata de albire a fost determinată prin normalizarea intensității fluorescente a probei pe lângă spotul de albire normalizat pentru intensitatea sa medie înainte de albire. Pentru a caracteriza deplasarea desthiobiotină/biotină, construcțiile de hidrogel Dex-TAB au fost consecutiv funcționalizate cu neutravidină, spălate cu PBS, funcționalizate cu desthiobiotină-FITC, spălate cu PBS și funcționalizate cu biotină-atto565, în timp ce au fost imaginate cu ajutorul microscopiei confocale cu fluorescență. În cele din urmă, hidrogelurile au fost spălate temeinic de mai multe ori cu PBS pentru a elimina B-ATTO nelegat și au fost imaginate cu ajutorul microscopiei confocale cu fluorescență pentru a cuantifica cantitatea relativă de D-FITC care a fost înlocuită cu B-ATTO. Experimentul a fost repetat cu alți compuși de biotină pentru a demonstra universalitatea acestei abordări. Mai exact, hidrogelurile Dex-TAB funcționalizate cu neutravidină/D-FITC au fost incubate și monitorizate continuu timp de 8 zile în prezența a 1 µM de biotină, peptidă biotinilată (adică, peptida B; secvența de aminoacizi KGLPLGNSH), HRP (B-HRP), imunoglobulină G (B-IgG) sau nanoparticule de aur (B-GNP) în PBS. Probele au fost spălate temeinic cu PBS timp de cel puțin o zi pentru a îndepărta fracțiunile nelegate înainte de analiza intensității D-FITC. Funcția biologică a B-HRP complexat supramolecular a fost evaluată cu ajutorul unui kit de colorare DAB, conform protocolului producătorului. Hidrogelurile biotinilate 3D în formă de os au fost create prin turnarea prin injecție a Dex-TAB într-o matriță din polidimetilsiloxan (PDMS) care a fost fabricată cu ajutorul unui master în formă de os în miniatură. Oasele de hidrogel au fost funcționalizate cu FITC într-o manieră omogenă prin incubarea ulterioară peste noapte cu soluții de neutravidină 1 µM, PBS și 1 µM D-FITC. După o spălare temeinică cu PBS, părțile superioare ale hidrogelurilor în formă de os au fost incubate cu 1 µM de B-ATTO folosind un strat de acoperire prin imersie temporizată și ulterior spălate cu PBS pentru a elimina fluoroforii nelegate și analizate cu ajutorul microscopiei cu fluorescență. Pentru a studia stabilitatea pe termen lung a complexării supramoleculare, două hidrogeluri Dex-TAB de aproximativ 5 × 5 × 5 × 5 mm au fost marcate exclusiv cu D-FITC și B-FITC, spălate temeinic cu PBS și legate covalent folosind un intermediar de Dex-TA pristinic (adică neetichetat) prin reticulare enzimatică a fracțiunilor de tiramină. Construcțiile de hidrogel combinate au fost apoi incubate în PBS și au fost imaginate în mod continuu cu ajutorul microscopiei confocale cu fluorescență timp de 2 săptămâni pentru a investiga stabilitatea modelelor deziobiotinilate și biotinilate. Intensitățile secțiunilor transversale ale tuturor imaginilor fluorescente au fost determinate cu ajutorul software-ului ImageJ.
Analiza rețelei hidrogelului
Analiza de difuzie a fost efectuată pentru a analiza efectul post-funcționalizării construcțiilor hidrogel Dex-TAB cu neutravidină multivalentă asupra proprietăților rețelei hidrogelului. În acest scop, construcțiile de hidrogel Dex-TAB pristine și construcțiile care au fost postfuncționalizate omogen folosind o cantitate excesivă de neutravidină au fost combinate cu dextran marcat cu FITC cu raze hidrodinamice RH = 2,3 nm (10 kDa), RH = 8,5 nm (150 kDa) și RH = 27 nm (2000 kDa). Construcțiile de hidrogel în soluțiile fluorescente au fost apoi analizate cu ajutorul imagisticii confocale cu fluorescență (Zeiss LSM 510), iar intensitatea fluorescentă în interiorul și exteriorul construcțiilor a fost cuantificată cu ajutorul software-ului ImageJ. Permeabilitatea relativă a moleculelor de dextran marcate fluorescent în Dex-TAB a fost determinată prin normalizarea intensității cu intensitatea fluorescentă din afara hidrogelurilor. Aceeași abordare a fost utilizată pentru a cuantifica și compara permeabilitatea relativă a Dex-TAB 5% (p/v) pentru anticorpii IgG convenționali marcați cu FITC și VHH.
Modificare și caracterizare VHH
Destiobiotina conjugată cu maleimidă a fost sintetizată prin reacția amino-maleimidei și a destiobiotinei-NHS timp de 2 h în tampon bicarbonat (pH 8). Desthiobiotina-maleimida a fost purificată prin cromatografie lichidă de înaltă presiune pe un modul de gradient cuaternar 2545 (Waters) de la 90%/10% apă/acetonitril (0,1% acid trifluoroacetic (TFA)) la 100% acetonitril (0,1% TFA). Produsul colectat a fost caracterizat prin spectrometrie de masă; MS(ESI): m/z = 336,96 (m/z calculat = 337,18 pentru C16H24N4O4). Solvenții au fost evaporați cu ajutorul unui evaporator rotativ în vid, după care destiobiotina-maleimida a fost resuspendată în apă milliQ, congelată în azot lichid și liofilizată peste noapte. VHH destiobiotinilate și biotinilate au fost sintetizate de QVQ BV prin reacția cisteinei nemodificate a VHH cu destiobiotina conjugată cu maleimidă și, respectiv, cu biotina conjugată cu maleimidă. Am utilizat ELISA pentru a evalua afinitatea față de BMP7 a VHH nemodificat față de VHH destiobiotinilat (D-@BMP7) și biotinilat (B-@BMP7). În acest scop, o placă Maxisorp cu 96 de godeuri a fost acoperită peste noapte la 4 °C cu 0,5 µg ml-1 de BMP7 uman în PBS. Plăcile au fost blocate cu 4% lapte degresat în PBS și s-au adăugat diferite concentrații (0-5 µM) de VHH în 1% lapte degresat. Detectarea VHH s-a realizat utilizând un anticorp policlonal de iepure împotriva VHH și un anticorp secundar de capră de iepure conjugat cu HRP. Adăugarea de H2O2 împreună cu TMB a identificat cantitatea de HRP prin transformarea într-un produs colorat. S-a adăugat H2SO4 pentru a opri reacția. Măsurătorile spectrofotometrice de absorbție au fost efectuate la 450 nm cu ajutorul unui cititor de plăci (Multiscan GO, ThermoFisher Scientific). Curbele doză-răspuns au fost obținute prin adaptarea unei funcții logistice la datele măsurate folosind Ecuația (4).
Cultură celulară
Celele C2C12-BRE-Luc au fost cultivate în mediu de cultură format din 20% (v/v) FBS, 1% (v/v), 100 U/ml Penicilină și 100 µg/ml Streptomicină în DMEM. Celulele au fost cultivate în condiții de 5% CO2 la 37 °C, iar mediul a fost înlocuit de 2 ori pe săptămână. Atunci când cultura celulară a ajuns aproape de confluență, celulele au fost detașate cu 0,25% (p/v) tripsină-EDTA la 37 °C și ulterior subcultivate sau utilizate pentru experimente. Viabilitatea celulelor încapsulate în Dex-TAB 5% (p/v) reticulat enzimatic a fost analizată imediat după încapsulare (adică în ziua 0) și după patru și șapte zile de cultură in vitro prin incubarea celulelor timp de 30 de minute cu 2 µM de calceină AM (vie) și 4 µM de EthD-1 (moartă) în PBS și vizualizarea celulelor marcate cu ajutorul microscopiei cu fluorescență. Analiza celulelor vii/morți a fost, de asemenea, efectuată în urma post-modificării hidrogelurilor Dex-TAB încărcate cu celule cu neutravidină, D-@BMP7 și B-@BMP7, utilizând același protocol de funcționalizare post-producție, așa cum a fost descris în secțiunea anterioară a metodelor „Refacerea Dex-TAB și post-funcționalizarea ortogonală”. Activitatea metabolică a celulelor a fost analizată prin colorarea celulelor cu 0,5 g l-1 MTT în mediul de cultură și vizualizarea ulterioară cu ajutorul microscopiei cu câmp luminos. Pentru experimentele de inducere a BMP7, celulele au fost însămânțate la 10.000 de celule cm-2 pe plastic de cultură tisulară și cultivate peste noapte. Celulele au fost înfometate folosind un mediu de cultură care conține 0,5% (v/v) FBS pentru o perioadă de 12 h. După înfometare, construcțiile prefabricate de hidrogel Dex-TAB/neutravidină, Dex-TAB/neutravidină/D-@BMP7, Dex-TAB/neutravidină/B-@BMP7 sau Dex-TAB/neutravidină/D-@BMP7 tratate cu biotină au fost adăugate la cultura celulară, care au fost ulterior expuse la 100 ng ml-1 de BMP7 timp de 10 până la 15 h (Fig. suplimentară 12). Ulterior, celulele au fost lizate cu ajutorul tamponului de liză reporter și a unui singur ciclu de congelare-dezghețare. Expresia luciferazei a fost determinată utilizând un test de luciferază conform protocolului producătorului și un luminometru (Victor X3, Perkin Elmer). Expresia luciferazei a fost normalizată în raport cu conținutul total de ADN, care a fost cuantificat folosind QuantiFluor dsDNA System conform protocolului producătorului și un fluorometru (Victor X3).
Reprezentarea datelor și statistică
Măsurătorile spectrofotometrice de absorbție a HABA au fost efectuate pe șase probe per condiție și raportate ca medie ± abaterea standard. Măsurătorile SPRi au fost efectuate pe șase spoturi per condiție și raportate ca medie ± abaterea standard (linii de culoare deschisă). Valorile SPRi ale spoturilor individuale au fost normalizate în raport cu Rmax al curbelor de legare a neutravidinei pentru a corecta diferențele de densitate a spoturilor (figura suplimentară 1). Valorile kon, koff și Kd ale interacțiunilor supramoleculare au fost determinate din cel puțin trei experimente SPRi și raportate ca medie ± abatere standard sau suprapunând punctele de date individuale. Măsurătorile FRAP ale streptavidinei marcate fluorescent au fost efectuate pe cel puțin patru construcții de hidrogel per condiție și raportate ca medie ± abatere standard normalizată la intensitatea medie înainte de albire. Măsurătorile intensității fluorescenței (confocale) (inclusiv experimentele time-lapse) au fost efectuate pe cel puțin patru construcții de hidrogel per condiție și raportate ca medie ± abatere standard sau suprapunând puncte de date individuale, toate normalizate la cea mai mare intensitate medie. Analiza de regresie liniară a fost efectuată cu ajutorul software-ului OriginPro 2016. Deplasarea D-FITC de către fracțiunile biotinilate a fost măsurată cu ajutorul microscopiei de fluorescență pe zece probe per condiție. Semnificația diferențelor a fost studiată utilizând o ANOVA cu o singură cale cu testul post-hoc Tukey (datele au fost distribuite în mod normal, după cum indică testul Shapiro-Wilk: p > 0,1). Permeabilizarea moleculelor de dextran marcate fluorescent, VHH și IgG în Dex-TAB a fost măsurată pe patru construcții de hidrogel per condiție și a fost raportată ca medie ± abatere standard. Semnificația diferențelor dintre permeabilitatea VHH și IgG a fost determinată cu ajutorul unui test Mann-Whitney. Cuantificarea vie/moartă a fost efectuată pe trei hidrogeluri încărcate cu celule pentru fiecare condiție și a fost raportată ca medie suprapusă peste punctele de date individuale. Semnificația diferențelor a fost determinată cu ajutorul unui test Kruskal-Wallis ANOVA. Analizele de răspuns la doză au fost efectuate utilizând trei eșantioane pentru fiecare concentrație și raportate ca medie ± abatere standard și o funcție logistică suprapusă și ajustată pe baza ecuației (4). Intervalele de încredere ale curbelor de răspuns la doză au fost generate automat de software-ul de trasare a graficelor. Inducția relativă a celulelor C2C12-BRE-Luc a fost măsurată pe trei eșantioane in vitro pentru fiecare condiție și a fost raportată ca medie ± abatere standard. Semnificația diferențelor a fost determinată cu ajutorul testelor Kruskal-Wallis ANOVA.
Schematică
Toate graficele au fost realizate cu ajutorul software-ului OriginPro 2016. Toate schemele au fost realizate utilizând software-ul ChemDraw Professional 16.0 și software-ul CorelDRAW X7.
Rezumat de raportare
Informații suplimentare despre designul cercetării sunt disponibile în Rezumatul de raportare a cercetării din Nature Research, legat de acest articol.
.