Akvarisk växt Azolla som universell råvara för produktion av biobränsle

Behandling av syntetiskt avloppsvatten med Azolla filiculoides

För experimentet med biologisk sanering framställdes selenrikt syntetiskt avloppsvatten (SeSW) genom att blanda en hög koncentration av fosfater (PO4-P), 1.3 g/L med en måttlig mängd ammoniak (NH4-N), 55 mg/L och en låg koncentration av nitrater (NO3-N), 15 mg/L (Additional file 4: Table S3). Denna sammansättning simulerar egenskaperna hos avloppsvatten från typiska industrier för färgning, efterbehandling och tvättmedelsproduktion av textilier. Avloppsvattnet kompletterades med 0,8 mg/L SeO2. I detta experiment använde vi 5-dagars behandling av SeSW med A. filiculoides. Tillväxthastigheten hos vissa vattenväxter som växer på avloppsvatten ökar normalt exponentiellt efter en fördröjningsfas under de första 4-5 dagarna då biomassan inte förändras nämnvärt . Denna period är dock förknippad med ett intensivt upptag av de viktigaste näringsämnena från avloppsvatten, vilket leder till en stark exponentiell tillväxt av vattenväxter efter den långsamma fasen . Avlägsnandet av näringsämnen i SeSW under de första fem dagarna av behandlingen med A. filiculoides ledde inte till statistiskt signifikanta förändringar (P ≤ 0,05) i biomassaproduktionen (0,3 ± 0,1 g dw). Det ledde dock till upp till 25,4 % upptag av NH4-N, 69,5 % upptag av NO3-N och 24,3 % upptag av PO4-P från 100 % SeSW (tabell 1; figur 1). Utspädd (50 %) SeSW var mindre påfrestande för A. filiculoides, vilket återspeglas i den högre upptagningsgraden av näringsämnen: 33,4, 93 och 39,8 % för NH4-N, NO3-N och PO4-P, respektive. Upptagningsgraden av näringsämnen hos A. filiculoides har tidigare rapporterats av flera forskargrupper.

Behandling av SeSW med A. filiculoides ledde till 40 % upptag av Se från 100 % SeSW och 76 % upptag från 50 % SeSW med absorptionshastigheter på 47,6 µg Se/L-dag respektive 39,9 µg Se/L-dag (fig. 2; tabell 2). Detta korrelerade med en ackumulation av 158,8 µg Se/g dw-dag i A. filiculoides från 100 % SeSW och 133,5 µg Se/g dw-dag från 50 % SeSW (tabell 2). Denna absorptionseffektivitet motsvarar 85 % och 83 % av det teoretiska maximala absorptionsvärdet för 50 % SeSW respektive 100 % SeSW. En ungefär liknande absorptionsgrad av Se uppvisades av en annan Azolla-representant, Azolla caroliniana, som absorberade upp till 1 mg Se/g dw från 2,5 mg/L Se-lösning under två veckors behandling. Detta är högre än för andra vattenväxter, Salvinia rotundifolia (0,7 mg Se/g dw), Lemna minor (500 mg Se/g dw) och Eichhornia (300 mg Se/g dw) .

Överlevnaden av P. australiensis som exponerats för utspädningar av SeSW visas i tilläggsfil 5: Figur S2. Det fanns ingen överlevnad (0 %) när de exponerades i 96 timmar för 100 % obehandlad (kontroll) SeSW. Inga levande räkor observerades heller i 80 % eller 50 % SeSW. Efter behandling med A. filiculoides minskade toxiciteten hos SeSW 2,6 gånger och LC50 ökade från 11,22 till 29,80 %. Detta visade att när 100 % SeSW behandlades med A. filiculoides reducerades dess toxicitet avsevärt redan efter 5 dagars behandling.

Biobränsleproduktion från Azolla

Ultima och proximala analyser av Azolla filiculoides

Resultaten av de proximala och ultimata analyserna av A. filiculoides-provet, inklusive det totala innehållet av flyktiga ämnen, fukt, fast kol och aska (dvs. oorganiska komponenter i proverna), sammanfattas i Additional file 6: Table S4. De totala flyktiga ämnena som samlades in vid 950 °C utgör 88 % av den totala produkten. Den totala produkten innehöll 11 % fukt, 7,3 % aska och 4,4 % fast kol. Proximatanalysen visade att nyckelelementen bestod av 46,2 % C, 7,4 % H, 3,0 % N, 43,2 % O och 0,2 % S (beräknat genom differens).

Thermogravimetriska analyser av Azolla filiculoides

TGA-DTG-analysen av A. filiculoides-provet utfördes vid ett temperaturintervall på 23-900 °C med en uppvärmningshastighet på 10 °C/min under en kväveatmosfär och visas i fig. 3. TGA- och DTG-kurvorna visade att A. filiculoides sönderdelades i tre steg under pyrolysprocessen; liknande resultat rapporterades av Agrawal och Chakraborty . Biomassan genomgick tre faser av viktförlust, en mellan 154 och 160 °C, den andra vid 180 och 580 °C och den tredje vid cirka 580 och 900 °C. Den första zonen representerar en liten viktförlust (7 %) orsakad av uttorkning av biomassaprovet. Den största viktförlusten (51 %) på grund av pyrolys ägde rum i den andra zonen, där de flesta flyktiga ämnen frigörs; den starka toppen visar att proteiner, kolhydrater och lipider bryts ned. I den tredje zonen sker en nedbrytning av den kolhaltiga produkten, och viktförlusten beror därför huvudsakligen på förgasning där mycket icke-flyktiga kolföreningar förångas och bildar CO och CO2 på grund av de höga temperaturerna .

Hydrotermisk förvätskning av Azolla filiculoides

Hydrotermisk förvätskning av A. filiculoides utfördes med destillerat vatten som lösningsmedel vid 260, 280 och 300 °C med uppehållstider på 15 minuter. Reaktionsförhållandena valdes baserat på våra tidigare studier och litteratur för att förstå effekten av temperatur på biooljeproduktutbytet av A. filiculoides under subkritiskt vatten . Produktfördelningen för det HTL-behandlade provet av A. filiculoides presenteras i figur 4. Den totala biooljeavkastningen var 15,83, 21,50 och 16,0 % vid 260, 280 respektive 300 °C. Den högsta avkastningen erhölls alltså vid 280 °C. Den totala biooljan bestod av eterfraktionen (Bio-oil1) som erhölls genom extraktion av den flytande delen och acetonfraktionen (Bio-oil2) som erhölls genom extraktion av den fasta fraktionen (avsnittet ”Metoder”). Bioolja2 hade hög viskositet och var en tjärig vätska. Avkastningen av fasta rester minskade kontinuerligt från 66,83 % till 33,83 % när temperaturen ökade från 260 till 300 °C. Avkastningen av gaser minskade vid övergången från 260 till 280 °C. När temperaturen var högre än 280 °C ökade avkastningen av gaser till 7,1 %. HTL av A. filiculoides biomassa visade en liknande fördelning av de två huvudprodukterna, biogas och biokol, som de uppgifter som erhållits efter pyrolys med en genomsnittlig biogas på 6,05 % och 12 % för HTL respektive pyrolys, och biokol omkring 50 % för båda. HTL genererade en högre nivå av bioolja, upp till 21,5 % (14 % för pyrolys). Liknande resultat erhölls när man jämförde med utbytet av bioolja från både pyrolys och HTL av mikroalger .

In tillägg till materialbalansdata undersöktes omvandlingen på grundval av totalt organiskt kol (TOC) som erhållits efter hydrotermisk förvätskning vid olika temperaturer, och resultaten presenteras i Additional file 7: Table S5. Det fanns 46,9 % organiskt kol i fodret, vilket motsvarar 2,8 g organiskt kol i de 6 g av provet som användes för hydrotermisk förvätskning. Omvandlingen av organiskt kol ökade från 13,93 till 48,93 % när temperaturen ökade från 260 till 300 °C. Resultaten tyder på att vid lägre temperatur var nedbrytningen av biomassa ofullständig och lämnade en stor mängd oreagerad biomassa kvar, vilket kan hindra bildningen av bioolja. En ytterligare temperaturökning, högre än 280 °C i våra experiment, skulle dock bryta ned den tidigare bildade biooljan/intermediaten till gaser och vattenlösliga produkter, vilket ledde till en minskning av biooljeutbytet. Den minskande avkastningen av den fasta restprodukten (biokol) tydde på en ökning av den totala biomassakonverteringen när temperaturen höjdes från 260 till 300 °C.

Fouriertransform-infrarödspektroskopi av bioolja

FT-IR-spektra av A. filiculoides-råvara och bioolja1 som erhållits från HTL vid 260, 280 och 300 °C visas i figurerna 5A och B. Det breda bandet vid cirka 3200-3405 cm-1 tillskrivs O-H- eller N-H-sträckningsvibrationen som orsakas av vatten eller O-H-grupper eller N-H-grupper som finns i biooljan (figur 5B). En bred absorbans visades vid cirka 3314 cm-1 för råvaran, vilket tyder på ett högt innehåll av kolhydrater och proteiner (fig. 5A).

Biooljorna uppvisade en svagare absorbans vid 3200-3405 cm-1, vilket tyder på att både kolhydrater och proteiner bröts ned i HTL-processen (fig. 5B). Banden från 2854 till 2950 cm-1 var starkare för alla biooljor på grund av C-H-sträckningsvibrationer, vilket tyder på förekomsten av alkyl-C-H-grupper. C=O-sträckningsvibrationen vid 1645-1720 cm-1 i biooljorna tyder på förekomst av ketoner, aldehyder, estrar eller syror . De böjande vibrationsbanden vid cirka 1580-1650 cm-1 tyder på förekomst av N-H-grupper från aminer. Banden i området 1430-1480 cm-1 tillskrivs α-CH2-böjningsvibrationer som förekommer i biooljorna. Förekomsten av C-N-sträckningsband runt 1266-1342 cm-1 i biooljorna beror på aromatiska amingrupper. Några andra absorptionstoppar vid 780-850 cm-1 kan också tillskrivas C-H-böjningsvibrationer utanför plan från aromater. Bandet vid 1040 cm-1 förekom endast i absorptionsprofilen för A. filiculoides-råvaran och kan vara C-O kopplat till hydroxylgrupper som dehydratiserades efter förvätskning. På det hela taget visar spektren för bioolja1-proverna från HTL vid de olika temperaturerna samma toppar, vilket tyder på förekomsten av samma funktionella grupper, och var de olika topparna som erhölls i NMR-spektren.

NMR-analys av bioolja

NMR-analysen av bioolja1-proverna genomfördes för att förstå förhållandet mellan de kemiska miljöerna för protonerna. NMR-spektren gav kompletterande information om funktionella grupper till FTIR-spektren och möjlighet att kvantifiera och jämföra integrationsområden mellan spektren. I likhet med FT-IR visade 1H NMR-spektren en hög andel alifatiska funktionella grupper för alla biooljor, och en sammanfattning av integrerade toppområden som tilldelats olika funktionella grupper visas i figur 6. Spektraets mest uppåtriktade område, från 0,5 till 1,5 ppm, representerar alifatiska protoner som är knutna till kolatomer minst två bindningar från en C=C-atom eller heteroatom (O eller N). Nästa helhetsområde från 1,5 till 3,0 ppm representerar protoner på alifatiska kolatomer som kan vara bundna till en C=C dubbelbindning. Alla biooljor hade en högre andel protoner i spektralområdet 0,5-3,0 ppm. De hade en högre andel (63,15-71,76 %) protoner i området 0,5-1,5 än i området 1,5-3,0 (18,73-28,8 %), vilket möjligen beror på det stora antalet kväve- och syrehaltiga föreningar som har visat sig resonera i detta område och som kan härröra från det höga proteininnehållet i råmaterialet.

Nästa del av 1H NMR-spektrumet vid 3,0-4,5 ppm representerar metoxylprotoner eller en metylengrupp som förenar två aromatiska ringar; mycket låga protonandelar observerades i detta område. Alla biooljor uppvisade en låg andel metoxi-/kolhydratfunktionalitet (4,5-6,0 ppm). I detta område var de högsta protonprocentvärdena för biooljorna 4,33 och 4,32 % för förvätskning vid 260 och 280 °C, det klart lägre värdet 0,94 % för förvätskning vid 300 °C. Spektrumområdet mellan 6,0 och 8,5 ppm motsvarar det aromatiska området. Den maximala protonhalten på cirka 7,2 % i detta område erhölls för biooljan som gjordes vid 300 °C. Aromatisk/heteroaromatisk funktionalitet observerades i alla biooljor (6,0-8,5 ppm) i överensstämmelse med resultaten från FT-IR-spektroskopi. De nedre spektrumområdena (8,5-10 ppm) härrör från aldehyderna. Aldehydfunktionalitet (9,5-10,0 ppm) saknades i alla biooljor trots de C=O-funktionella grupperna (1645-1720 cm-1) som observerades med FT-IR. Uppkomsten av sådana FT-IR-band kan också bero på andra karbonylbärande grupper som protonerade karboxylsyror, karboxylsyraestrar, amider och ketoner.

GC-MS-analys av bioolja

GC-MS utnyttjades för att ytterligare förstå den flytande produktens sammansättning och för att bekräfta resultaten från FT-IR- och NMR-analyserna. GC-MS visade tydligt att förvätskningstemperaturen påverkade biooljans komponenter1. Identifieringen av föreningarnas huvudtoppar utfördes med hjälp av NIST:s masspektraldatabas. HTL-experimenten resulterade i biooljor som uppstod genom nedbrytning av lignin, proteiner, flavonoider och lipider tillsammans med en rad kolhydratbaserade föreningar. Komponenterna i biooljor identifierades som mono- och polycykliska aromatiska föreningar, ketoner, aldehyder, estrar, alkoholer, amider och andra kväveinnehållande föreningar (inklusive amider och N-heterocykliska föreningar) samt kolväten. En semikvantitativ analys utfördes genom att beräkna den relativa procentandelen av arean av de kromatografiska topparna med de resultat som visas i tabell 3. De viktigaste föreningarna som observerades vid hydrotermisk förvätskning av A. filiculoides var metylpyrazin, 2-metyl 2-cyklopenten-1-on, fenol, 2-metoxifenol, 3-pyridinol, katekol, prolin, N-butoxikarbonylbutylester, bis(2-etylhexyl)ftalat och beta-sitosterol. När temperaturen för hydrotermisk förvätskning varierade från 260 till 300 °C producerades olika föreningar och olika proportioner av föreningar. Arealprocenten för fenolföreningar som fenol (6,1-18,8 %) och katekol (10,0-15,7 %) ökade när temperaturen ökade från 260 till 280 °C, men minskade sedan till 11,1 % för fenol och 11,8 % för katekol vid 300 °C. Fenolerna i biooljan från A. filiculoides producerades sannolikt från ligninet eller kolhydratdelen av biomassan. Nitrerade föreningar bildas genom dekarboxylering, deaminering, dehydrering, depolymerisering och nedbrytningsreaktioner av proteiner . Den högsta procentuella arean av 3-pyrindiol (13,3 area %) observerades vid den lägsta temperaturen 260 °C och minskade till 11,9 och 10,1 area % vid 280 respektive 300 °C. Dessutom observerades den största arean (13,6, 12,4 och 8,7 %) vid 260, 280 och 300 °C. Eftersom sammansättningen av den flytande produkten är så komplex skulle ytterligare uppgradering, såsom denitrogenering och deoxygenering, vara nödvändig för att göra biooljan lämplig för motorbränslen.

Sammansättningen av molekylerna i biooljan från HTL jämfördes med det spektrum av molekyler som identifierats i den pyrolysgenererade biooljan. Till skillnad från HTL är pyrolys en termokemisk nedbrytning av torrt organiskt material med en fukthalt under 10 % massfraktion i frånvaro av syre, vid atmosfäriskt tryck och högre temperaturer (350-550 °C) . Båda de termokemiska teknikerna visade sig ha stor potential för att omvandla hela Azolla-biomassan till biooljor som har högre energitäthet än den ursprungliga biomassan. Biooljor från båda de termokemiska reaktionerna har en mycket komplex sammansättning till följd av depolymerisering och nedbrytning av biomassans monomerer genom klyvning, dehydrering, dekarboxylering och deaminering . Proteinbaserade föreningar representerades av fenoler, alkylfenoler, pyrrolidinon, indol och nitril som ett resultat av nedbrytning av aminosyrorna tyrosin och fenylalanin som finns i Azolla . Lipidderivatprodukterna omfattade en rad långkedjiga mättade alkaner och fettsyror med en storlek från C12 till C21: dodekan, tridekan, tetradekan, pentadekan, hexadekan, heptadekan, oktadekan, nonadekan, eicosan och heneicosan. En liknande blandning av långkedjiga alkaner som härstammar från lipider och som är pyrolyspyrolyserade biovätskeprodukter har påträffats i alger . Den största skillnaden var att pyrolysen av A. filiculoides visade ackumulering av fytol, 3,7,11,15-tetrametyl-2-hexadecen-1-ol, acyklisk diterpenalkohol, eftersom produkten av nedbrytningen av klorofyll var den vanligaste pyrolysprodukten.

Analys av biorestprodukter

Figur 7 visar FT-IR-spektra av Azolla-råvaran och biorestprodukterna. De breda banden vid 3200-3405 cm-1 är tilldelade sträckningsvibrationerna hos vätebundna O-H-grupper och N-H-grupper och indikerar förekomsten av polysackarider, kolhydrater och proteiner i Azollafodret. De första Azolla-råvarorna har starka toppar av sträckningsvibrationer som motsvarar O-H- och N-H-grupperna, men denna genomskinlighet minskar i bio-residuen. Toppen vid 1030 cm-1 försvann i bioresiden. Toppen runt 1600-1620 cm-1 som motsvarar N-H-böjningsvibrationen fanns i Azolla-foder och Azolla-biosubstans. Topparna mellan 2800 och 2930 cm-1 i restprodukternas spektrum blev mycket svagare än topparna i Azolla-råvaran. Förekomsten av en enda topp vid 1590 cm-1, som tillskrivs C=C-sträckningen, indikerar bildandet av aromatisk biokol .

Röntgendiffraktionsspektren (XRD) av A.filiculoides foder och bio-residues vid olika temperaturer visade inga signifikanta skillnader i pulverröntgendiffraktogrammet (Additional file 8: Figur S3). Biomassans foder och restprodukter som erhållits vid olika temperaturer uppvisade en typisk amorf natur, vilket tyder på att kolstrukturen i restprodukterna är högkonjugerade aromatiska blad som är tvärbundna på ett slumpmässigt sätt. Morfologiska förändringar var uppenbara i bilderna från svepelektronmikroskopi (SEM) av Azolla och biorester (tilläggsfil 9: figur S4). Bilderna av bioresterna som erhållits genom hydrotermisk förvätskning av de tre Azolla-biokarren visade att resterna var svampiga till sin natur och att det inte fanns någon ordnad porös struktur.

Vätgasproduktion från syrabehandlad Azolla-biomassa med Enterobacter cloacae DT-1

Under förbehandling med värme-H2SO4 hydrolyserades A. filiculoides-biomassa till olika lösliga reducerade sockerarter som huvudsakligen bestod av glukos (1,18 g/L), xylos (1,39 g/L) och arabinos (0,063 g/L). Det syrabehandlade förhydrolysatet användes som råmaterial för vätgasproduktion av Enterobacter cloacae (E. cloacae) i satsvis drift under minskat partialtryck pH2. pH2 påverkar avsevärt effektiviteten av vätgasavkastningen vid fermentativ vätgasproduktion av anaeroba bakterier eftersom vätgasproduktionsvägarna är känsliga för vätgaskoncentrationen, vilket leder till att slutprodukten hämmas. Det har rapporterats att ett högt partialtryck för väte leder till produktion av fler reducerade produkter som etanol och laktat i stället för acetat, butyrat och H2. Satsfermenteringen var anordnad så att den utövade ett tryck på fermenteringens huvudutrymme, vilket gjorde att biogasen kunde passera ut ur huvudutrymmet omedelbart efter att den hade bildats, vilket minskade det totala partialtrycket och därmed vätgaspartialtrycket i satsfermenteringen.

Fermentering med E. cloacae DT-1 ledde till en produktion av 53 mmol/L vätgas (tabell 4). Under den fermentativa vätgasproduktionen sjönk det slutliga pH-värdet i fermentationsbuljongen från 7,5 till 5,42, vilket kan tillskrivas produktionen av kortkedjiga organiska fettsyror . Den totala produktionen av flyktiga fettsyror var 1150 mg/L, till stor del bestående av ättiksyra (986 mg/L) och smörsyra (161 mg/L), med ett B/A-förhållande på 0,165. DT-1-stammen följde alltså den blandade syravägen och utnyttjade effektivt C5-sockren (xylos, arabinos och glukos) från det syrabehandlade förhydrolysatet. Vätgasavkastningen var 2,43 mol H2/mol reducerande socker. Eftersom den maximala teoretiska väteavkastningen från den mörka fermenteringsmetoden är 4 mol H2/mol glukos, erhölls ungefär 60 % av den maximala möjliga väteavkastningen från det syrabehandlade prehydrolysatet av biomassa. Såvitt vi vet är detta den första rapporten om väteproduktion från socker från A. filiculoides biomassa.

Vätgasproduktion från enzymatiskt behandlad Azolla biomassa av E. cloacae DT-1

Enzymatisk hydrolys av syrabehandlad A. filiculoides biomassa frigjorde glukos och xylos i en koncentration av 1,49 respektive 0,181 g/l. Omkring 34,8 mmol/L volymetrisk vätgasproduktion (under minskat pH2) erhölls från de enzymatiskt hydrolyserade biomassasockren. Fermenteringsbuljongens slutliga pH sjönk till 5 under vätgasproduktionen, vilket åtföljdes av produktion av ättiksyra (990 mg/L) och smörsyra (164 mg/L). Den totala VFA-koncentrationen var 1156 mg/L och B/A-förhållandet var 0,165 (tabell 4). Dessa resultat visar att man följde den blandade syrafermenteringsvägen. Vätgasavkastningen var 2,04 mol H2/mol reducerande socker; den var därför lägre än den som erhölls från det syrabehandlade förhydrolysatet. Totalt sett var väteavkastningen hos DT-1-stammen från Azolla filiculoides biomassa 2,2 ± 2 mol/mol reducerande socker. Effektiviteten för vätgasproduktion från Azolla liknar den som erhållits för terrestrisk lignocellulosisk råvara som täcker intervallet 044-2,76 mol H2/mol socker (Additional file 1: Table S1, Additional file 10: Table S6).

Kol-till-kväve-förhållandet (C/N) i biomassan är viktigt för en effektiv anaerob nedbrytning eftersom mikroorganismerna kräver betydligt mer C än N (C:N på 25:1) för en optimal vätgasproduktion. Därför är tillämpningen av mikroalger för vätgasproduktion begränsad eftersom de är rika på proteiner och har ett lågt C/N-förhållande (genomsnittligt 4) . Samfermentering med makroalger (t.ex. Laminaria digitata), som är rika på kolhydrater med ett högt C/N-förhållande, förbättrar vätgasproduktionen . A. filiculoides innehåller 41 % totala kolhydrater och 20 % proteiner, vilket resulterade i att den proximala analysen av biomassan visade ett C/N-värde på 15 (Additional file 6: Table S4), vilket är nära att vara en effektiv råvara för produktion av biovätgas.

Etanolproduktion från Azolla filiculoides och A. pinnata

Kemisk analys av biomassor från A. filiculoides och A. pinnata visas i Additional file 3: Table S2. A. filiculoides uppvisade en hög koncentration av biomolekyler som kan användas som råvara för produktion av bioetanol: stärkelse (6,05 %), cellulosa (21,8 %) och hemicellulosa (13,5 %). Den innehåller 10,3 % lignin, vilket är högre än i andmat och andra vattenväxter men lägre än i de viktigaste lignocellulosa bioenergigrödorna (Additional file 1: Table S1). Den kemiska analysen av A. pinnata visade en lägre koncentration av bioetanolproducerande molekyler: stärkelse (4,7 %), cellulosa (12,8 %) och hemicellulosa (10,1 %) och högre ligninhalt (upp till 13,2 %).

Stärkelsekomponenten i A. filiculoides och A. pinnata hydrolyserades enzymatiskt av α-amylas och α-amyloglukosidas, och cellulosa/hemicellulosakomponenterna hydrolyserades av cellulas och cellobias. Mängderna frigjord glukos visas i tabell 5. Som förväntat gav kombinationen av fyra enzymer som hydrolyserade A. filiculoides biomassa en högre mängd glukos än för A. pinnata (upp till 65,9 respektive 29,5 g/L). Denna glukosavkastning var mycket högre än efter behandling av A. filiculoides biomassa med en suspension av levande Aspergillus niger odlad på potatisdextrosbuljong (2,5 g/L glukos) enligt Pandey et al. .

Efter jäsning av reducerat socker med Saccharomyces cerevisiae avspeglade etanolavkastningen, YE/G (etanol/glukos, g/g) mängden frigjord glukos i proverna, med avkastningar på 0,56 g/g observerade för A. filiculoides och 0,28 g/g för A. pinnata. Avkastningen på 0,56 g/g är jämförbar med den som rapporterats från fermentering av hydrolysat av andmat och vissa energigrödor (Additional file 1: Table S1). Intressant nog visade tillägg av ytterligare näringsämnen till jäsningen ingen signifikant ökning av etanolavkastningen (visas inte). Detta kan förklaras av att de viktigaste näringsämnena för jästtillväxt finns i biomassan hos båda Azolla-arterna.

Etanolavkastningen baserad på A. filiculoides biomassa (YE/B) fastställdes till 0,09 g/g, vilket liknar avkastningen från S. cerevisiae ATCC 24859 som odlats på andmat L. minor, som innehöll i genomsnitt 10 % stärkelse. En högre etanolavkastning, 0,19 g/g, observerades för Lemna aequinoctialis stam 6000 som har en snabb tillväxthastighet och förmåga att ackumulera höga nivåer av stärkelse (upp till 39 %) . Potentialen hos en annan representant för andmat, Spirodela polyrrhiza, att öka sin stärkelsenivå under stressförhållanden upp till 45,7 % tillsammans med enzymatisk hydrolys med α-amylas, pullulanas och α-amyloglukosidas ledde till en YE/B på 0,28 g/g . Cellväggarnas kemiska sammansättning och lägre stärkelseackumulering var den troliga orsaken till det lägre etanolutbytet från A. pinnata-biomassa (YE/B = 0,05 g/g). Användning av olika jäststammar som bättre kan fermentera spektrumet av frigjorda sockerarter, och som är mer toleranta mot potentiella hämmare, kommer att vara nästa steg i optimeringen av etanolavkastningen från Azolla biomassa.

Azolla som universell råvara för produktion av biobränsle

En systematisk analys av landväxter för att se om de har potential att bli idealiska bioenergigrödor ledde till ett antal viktiga urvalskriterier, som inkluderar: (1) kemisk sammansättning och hög andel biobränsleproducerande molekyler, (2) hög tillväxttakt/biomassaproduktion, (3) högt skördeindex/rotationsperiod, (4) förmåga att växa på marginella marker och brist på konkurrens med jordbruksgrödor om åkermark, (5) hög sötvattenanvändningseffektivitet och låg odlingskostnad, (6) låg skördekostnad, och (7) produktion av högvärdiga samprodukter. Dessa kriterier har lett till ett intensivt sökande efter domesticering av nästa generations energigrödor.

Azollaarter tillsammans med deras evolutionära cyanobakteriella symbiont, A. azollae, har väckt uppmärksamhet på grund av deras potential att uppfylla alla de kriterier som nämns ovan. För det första innehåller Azollas biomassa viktiga typer av energimolekyler som omfattar cellulosa/hemicellulosa, stärkelse och lipider som liknar kombinationer av lignocellulosa-, stärkelse- och oljeproducerande terrestra bioenergigrödor och mikroalger/cyanobakterier. För det andra är de en av de snabbast växande växterna genom att de fördubblar sin biomassa var 5-6:e dag och har en hög årlig produktivitet, vilket gör att de kommer på andra plats efter mikroalgerna när det gäller produktion av biomassa. I likhet med mikroalger är deras biomassaproduktion inte säsongsbunden. För det tredje kan Azolla odlas effektivt utanför sin naturliga livsmiljö med avloppsvatten som huvudsaklig näringskälla. Bioremediering av avloppsvatten kan leda till absorption av upp till 2,6 respektive 0,434 t/ha år av totalt N och P . Azolla kan också växa effektivt i N-utarmade medier och absorbera upp till 0,4 ton N/ha-år kväve från atmosfären genom symbios med A. azollae. För det fjärde är de lätta att skörda. Slutligen har Azolla-arter använts i årtionden som biologiska kvävegödselmedel och djur- och fiskfoder (på grund av deras höga protein- och kolhydratnivåer). Att man inte behöver använda syntetiska kvävebaserade gödselmedel för att odla Azolla ger en betydande positiv inverkan på minskningen av genereringen av lustgas (N2O), vars inverkan på uppvärmningen av atmosfären är nästan 300 gånger större än koldioxidens .

Thermokemiska tekniker

Azollabiomassa användes som råvara för produktion av bioolja, biokol och biogas med hjälp av två termokemiska tekniker, pyrolys och HTL (detta arbete). Med tanke på Azollas höga årliga produktivitet leder detta till en teoretisk produktion av pyrolys- och HTL-baserade biooljor på upp till 13,2 respektive 20,2 ton/ha år. Båda biooljorna innehåller en rad petrokemiska ämnen som kan användas direkt som glycerinfria komponenter i biodiesel eller uppgraderas till biobränslen med hjälp av vissa väletablerade tekniker . Båda de termokemiska teknikerna kan också producera bio-solider, t.ex. bio-karbon och aska (upp till 48 ton/ha-år för båda), som kan användas för att förbättra markkvaliteten genom att öka deras förmåga att hålla kvar näring och fukt, stödja mikrobiella samhällen och främja rotverksamheten . Aska från Azolla innehåller alkalielement (Li, Na, K, Mg, Ca) samt mikroelement som Fe, Mn och Cu vilket gör den till en bra kandidat för användning som gödselmedel .

Biodieselproduktion

Växer man på avloppsvatten kan den årliga teoretiska avkastningen av rå lipider från A. filiculoides uppskattas till 1,68 t/ha-år. Denna mängd kan ökas till 8 t/ha-år om växten växer under naturliga förhållanden med en produktivitet på omkring 100 t dw/ha-år. Denna oljeproduktivitet är betydligt högre än från sojabönor (0,44 t/ha-år), solrosor (0,78 t/ha-år), raps (1,17 t/ha-år) och oljepalmer (6,0 t/ha-år), men lägre än den teoretiska avkastningen från mikroalger (upp till 73 t/ha-år, för Nannochloropsis sp.) . Eftersom Azolla/A. azollae innehåller en rad C16:0-, C18:2- och C18:3-fettsyror innebär deras omvandling till metylestrar att den resulterande biodieseln uppfyller de avgörande kraven på bränsletäthet, cetantal och jodvärde för biodiesel enligt standarden EN14214 .

Etanolproduktion

Den teoretiska etanolproduktionen från A. filiculoides är 9,3 t/ha-år (11,7 × 103 L/ha-år, baserat på etanolens specifika volym = 0,789 g/mL), vilket är lägre än etanolproduktionen från sockerrör (25 × 103 L/ha-år), men ligger nära etanolproduktionen från majsstubbar (13.31 × 103 L/ha-år), men högre än från miscanthus (2,3 × 103 L/ha-år), pil (0,3 × 103 L/ha-år) och poppel (1,3 × 103 L/ha-år) (Additional file 1: Table S1).

Bioväteproduktion

Den höga avkastningen av biomassaproduktion, den kemiska sammansättningen (C/N-förhållandet) och den höga bioväteavkastningen från 2.2 mol/mol substrat gör Azolla till en konkurrenskraftig råvara för vätgasproduktion jämfört med andra bioenergigrödor (Additional file 1: Table S1, Additional file 10: Table S6).