Just när du tror att du har hittat det perfekta fixeringsmedlet för din vävnad finns det något annat att tänka på – ditt fixeringsmedel kan just ha maskerat alla de antigenplatser som din fina nya antikropp skulle binda till!
Har du just maskerat ditt antigen?
Som jag nämnde i en av mina tidigare artiklar skapar den fixeringsteknik du valt vanligtvis tvärbindningar inom proteiner; detta är ett av sätten att stabilisera vävnad. Detta kan förändra proteinets biokemi så att det intressanta antigenet maskeras och inte längre kommer att kännas igen av din primära antikropp.
Oroa dig inte – det finns hjälp att få!
Maskering av antigenet kan orsakas inte bara av tvärbindning av aminosyrorna inom epitopen, utan också av tvärbindning av obesläktade peptider på eller i närheten av en epitop, förändring av konformationen av en epitop eller förändring av antigenets elektrostatiska laddning. Eftersom erkännandet av antigen-antikroppar är beroende av proteinstrukturen är det viktigt att försöka återställa den naturliga 3D-strukturen. Oroa dig inte – det finns ett antal tekniker tillgängliga för att komma förbi detta.
Maskera av dig!
Vissa antikroppar kräver inte någon form av avmaskning, men om din antikropp gör det behöver du inte få panik – det är bara ett kort tillägg till ditt vanliga protokoll. Termen antigen retrieval avser alla tekniker där maskeringen av en epitop upphävs och bindningen mellan epitop och antikropp återställs. Vilken typ av antigenåtervinning som används beror på många variabler, bl.a. målantigenet, den antikropp som används, vävnadstypen och den fixeringsmetod som används för att bevara vävnaden. Om du till exempel använder en polyklonal antikropp, som känner igen flera epitoper, är det mindre troligt att det krävs antigenhämtning, men det är också troligt att det finns lite extra bakgrund. Om du använde en fixeringsteknik som etanol rekommenderas inte antigenhämtning eftersom fixeringen kanske inte är tillräckligt stark för att hantera hämtningsförhållanden.
Värme eller enzymer – du väljer
Det finns flera olika tekniker för att återställa immunoreaktiviteten hos en epitop och dessa faller generellt sett in i två huvudkategorier; a) enzyminducerad antigenhämtning och b) värmebaserad antigenhämtning. Inom varje kategori finns det också ett antal olika sätt att utföra återtagningen.
Enzyminducerade metoder
I de enzyminducerade metoderna kan enzymer, inklusive Proteinase K, Trypsin och Pepsin, användas för att återställa en antikropps bindning till sin epitop. Verkningsmekanismen tros vara klyvning av peptider som kan maskera epitopen. De viktigaste enzyminducerade metoderna, som kräver en 10-20 minuters inkubation vid 37?C, är:
- Proteinase K (20 g/ml i TE-buffert, pH 8)
- Trypsin (0,5 % i dH20)
- Pepsin (0,1 % i 10 mM HCl)
- Pronas (0,5 eller 0.1 % i dH20)
- Proteas (0,5 % i dH20)
Beroende på vilken metod du väljer måste varje metod optimeras för olika vävnadstyper och antikroppar, men var och en av dessa metoder passar in före blockering och efter avvaxningsstegen. Nackdelarna med dessa metoder är den låga framgångsfrekvensen när det gäller att återställa immunoreaktiviteten och risken för att förstöra både vävnadsmorfologin och det aktuella antigenet.
Om du tycker att det enzyminducerade sättet är lite för hårt, eller att det helt enkelt inte fungerar för dig, kan du pröva den värmeinducerade metoden. Denna metod tros upphäva vissa tvärbindningar och gör det möjligt att återställa epitopens sekundära eller tertiära struktur. Det är i huvudsak en åternaturering av strukturen hos fasta proteiner genom en serie konformationsförändringar.
Värmeinducerade metoder
Detta kan inkludera en möjlig hydrolys (brytning) av formalininducerade tvärbindningar där hela processen drivs av värmeenergi från värmekällan. Liksom de enzyminducerade metoderna kräver de värmeinducerade metoderna optimering. Dessa metoder, som kräver 10-40 minuter i en ångare, mikrovågsugn (stegvis fem minuter) eller vattenbad vid 95-100?C följt av 20 minuters nedkylning vid rumstemperatur, är:
- Citratbuffert (10 mM natriumcitrat, 0,05% Tween 20, pH 6)
- Citrat-EDTA-buffert (10 mM natriumcitrat, 2 mM EDTA, 0.05% Tween 20, pH 6,2)
- EDTA (1 mM EDTA, 0,05% Tween 20, pH 8)
- Tris-EDTA (10 mM Tris-bas, 1 mM EDTA, 0,05% Tween 20, pH 9)
- Glycin-EDTA (50 mM Glycin-HCl, 0.01% EDTA, pH 3,5)
I allmänhet används de värmeinducerade metoderna i större utsträckning, förmodligen för att de är mer framgångsrika. Om du precis har börjat med antigenhämtning är den beprövade och testade metoden med citratbufferthämtning ett bra ställe att börja med. Om den inte fungerar har du naturligtvis mycket att prova efteråt.
Har detta hjälpt dig? Dela gärna med dig till ditt nätverk.