Právě když si myslíte, že jste našli dokonalé fixační činidlo pro vaši tkáň, je třeba vzít v úvahu něco jiného – vaše fixační činidlo možná právě zamaskovalo všechna antigenní místa, na která se měla vázat vaše krásná nová protilátka!
Zamaskovali jste právě svůj antigen?
Jak jsem se zmínil v jednom z mých předchozích článků, vámi zvolená fixační technika obvykle vytváří příčné vazby v proteinech; to je jeden ze způsobů, jak se tkáň stabilizuje. To může změnit biochemii proteinu tak, že antigen, který vás zajímá, je maskován a nebude již rozpoznán vaší primární protilátkou.
Nezoufejte – pomoc je po ruce!
Maskování antigenu může být způsobeno nejen zesíťováním aminokyselin v epitopu, ale také zesíťováním nepříbuzných peptidů v epitopu nebo jeho blízkosti, změnou konformace epitopu nebo změnou elektrostatického náboje antigenu. Protože rozpoznávání antigenů a protilátek závisí na struktuře bílkovin, je důležité pokusit se obnovit přirozenou trojrozměrnou strukturu. Nebojte se – existuje řada technik, jak se s tím vypořádat.
Odstraňte masku!“
Některé protilátky nevyžadují žádné odmaskování, ale pokud ta vaše ano, nepanikařte – je to jen krátké doplnění vašeho obvyklého protokolu. Termínem antigen retrieval se označuje jakákoli technika, při které se zruší maskování epitopu a obnoví se vazba mezi epitopem a protilátkou. Typ antigen retrieval závisí na mnoha proměnných, mezi které patří cílový antigen, použitá protilátka, typ tkáně a metoda fixace použitá k uchování vaší tkáně. Pokud například používáte polyklonální protilátku, která rozpoznává více epitopů, je méně pravděpodobné, že bude vyžadovat zpětné získání antigenu, ale je také pravděpodobné, že bude mít trochu vyšší pozadí. Pokud jste použili fixační techniku, jako je etanol, pak se vyhledávání antigenu nedoporučuje, protože fixace nemusí být dostatečně silná, aby zvládla podmínky vyhledávání.
Teplo nebo enzymy – vybíráte si
Existuje více technik pro obnovení imunoreaktivity epitopu a ty se obecně dělí do dvou hlavních kategorií: (a) vyhledávání antigenu pomocí enzymů a (b) vyhledávání antigenu pomocí tepla. Také v rámci každé kategorie existuje řada různých způsobů, jak získat antigen.
Metody indukované enzymy
U metod indukovaných enzymy lze k obnovení vazby protilátky na její epitop použít enzymy včetně proteinázy K, trypsinu a pepsinu. Předpokládá se, že mechanismus účinku spočívá ve štěpení peptidů, které mohou maskovat epitop. 1 % v dH20)
V závislosti na tom, kterou metodu zvolíte, musí být každá z nich optimalizována pro různé typy tkání a protilátek, ale každá z těchto metod se vměstná před blokování a po krocích odvoskování. Nevýhodou těchto metod je nízká úspěšnost obnovení imunoreaktivity a možnost zničení morfologie tkáně i antigenu, který vás zajímá.
Pokud se vám zdá enzymem indukovaný způsob příliš drsný nebo vám prostě nevyhovuje, můžete vyzkoušet metodu indukovanou teplem. Předpokládá se, že tato metoda zvrátí některé příčné vazby a umožní obnovit sekundární nebo terciární strukturu epitopu. V podstatě se jedná o opětovnou saturaci struktury fixovaných proteinů prostřednictvím série konformačních změn.
Metody indukované teplem
Tato metoda může zahrnovat možnou hydrolýzu (přerušení) formalinem indukovaných příčných vazeb, přičemž celý proces je poháněn tepelnou energií ze zdroje tepla. Stejně jako u metod indukovaných enzymy vyžadují metody indukované teplem optimalizaci. Tyto metody, které vyžadují 10-40 minut v parním hrnci, mikrovlnné troubě (v pětiminutových intervalech) nebo ve vodní lázni při teplotě 95-100?C, po nichž následuje 20 minut chlazení při pokojové teplotě, jsou:
- Citrátový pufr (10 mM citrát sodný, 0,05% Tween 20, pH 6)
- Citrát-EDTA pufr (10 mM citrát sodný, 2 mM EDTA, 0.05% Tween 20, pH 6,2)
- EDTA (1 mM EDTA, 0,05% Tween 20, pH 8)
- Tris-EDTA (10 mM Tris báze, 1 mM EDTA, 0,05% Tween 20, pH 9)
- Glycin-EDTA (50 mM Glycin-HCl, 0.01% EDTA, pH 3,5)
Všeobecně se více používají metody vyvolané teplem, pravděpodobně proto, že jsou úspěšnější. Pokud s vyhledáváním antigenů teprve začínáte, pak je dobré začít osvědčenou metodou vyhledávání v citrátovém pufru. Samozřejmě, pokud nebude fungovat, pak máte spoustu možností, co vyzkoušet poté.
Pomohlo vám to? Pak se prosím podělte se svou sítí.
.