Vliv teploty a relativní vlhkosti na životaschopnost koronaviru SARS

Abstrakt

Předpokládá se, že hlavní cestou přenosu infekce SARS CoV jsou respirační kapénky. Virus je však detekovatelný i v jiných tělesných tekutinách a exkretech. Byla studována stabilita viru při různých teplotách a relativní vlhkosti na hladkých površích. Virus vysušený na hladkém povrchu si zachoval životaschopnost po dobu více než 5 dnů při teplotách 22-25 °C a relativní vlhkosti 40-50 %, tj. v typickém klimatizovaném prostředí. Životaschopnost viru se však rychle ztrácela (>3 log10) při vyšších teplotách a vyšší relativní vlhkosti (např. 38 °C a relativní vlhkost >95 %). Lepší stabilita koronaviru SARS při nízké teplotě a nízké vlhkosti prostředí může usnadnit jeho přenos v komunitě v subtropické oblasti (jako je Hongkong) během jara a v klimatizovaném prostředí. To může také vysvětlovat, proč v některých asijských zemích v tropické oblasti (jako je Malajsie, Indonésie nebo Thajsko) s vysokou teplotou a vysokou relativní vlhkostí prostředí nedošlo k většímu propuknutí SARS v komunitě.

1. Úvod

Těžký akutní respirační syndrom (SARS), byl nově se objevující nemocí spojenou s těžkým zápalem plic a v roce 2003 se rozšířil do více než 30 zemí na 5 kontinentech. Jako jeho původce byl identifikován nový koronavirus . SARS měl dramatický dopad na zdravotnické služby a ekonomiku postižených zemí a celková úmrtnost se odhadovala na 9 %, u osob starších 60 let však stoupala až na 50 % . Pozoruhodným rysem tohoto onemocnění byla jeho náchylnost k přenosu ve zdravotnickém zařízení a na blízké rodinné a sociální kontakty. Předpokládá se, že onemocnění se šíří kapénkami, blízkým přímým nebo nepřímým kontaktem, ale relativní význam těchto způsobů přenosu je v současné době nejasný. Studie ukázala, že tvorba virového aerosolu pacientem se SARS je možná, a proto je možným způsobem přenosu kapénkový přenos vzduchem . Úloha fomitů a kontaminace prostředí při přenosu infekce je však v současné době stále nejasná. Propuknutí onemocnění, které postihlo více než 300 obyvatel ve výškovém bytovém domě (Amoy Gardens) v Hongkongu, nebylo možné vysvětlit přenosem respiračními kapénkami od infikovaných pacientů . Infekční virus byl detekován ve výkalech , a za způsob přenosu této epidemie se považuje aerosolizace viru v kontaminovaných výkalech .

My a další jsme uvedli, že infekčnost viru SARS CoV (SARS coronavirus) se ztratila po zahřátí na 56 °C po dobu 15 minut, ale po vysušení na plastu byl stabilní po dobu nejméně 2 dnů. Byl zcela inaktivován běžnými fixačními prostředky používanými v laboratoři. Jiná studie ukázala, že byl inaktivován ultrafialovým světlem, alkalickými () nebo kyselými () podmínkami . Bylo prokázáno, že lidské koronaviry přežívají v PBS nebo kultivačním médiu s 5-10 % FCS několik dní, ale po vysušení přežívají pouze několik hodin . Byly provedeny některé studie, které uvádějí souvislost mezi propuknutím SARS, metrologickými faktory a znečištěním ovzduší . Informace o přežívání koronaviru SARS (SCoV) v prostředí za různých teplotních a vlhkostních podmínek jsou tedy pro pochopení přenosu viru velmi zajímavé. Nedávná studie s použitím náhradních koronavirů (virus přenosné gastroenteritidy (TGEV) a virus myší hepatitidy (MHC)) zkoumala vliv teploty a relativní vlhkosti vzduchu na přežívání koronavirů na povrchu . Vliv těchto faktorů prostředí na přežívání koronaviru SARS zůstává nejasný. V této studii uvádíme stabilitu koronaviru SARS při různých teplotách a relativní vlhkosti vzduchu.

2. Materiál a metody

2.1. Materiál a metody

2.2. Materiál a metody

2.3. Materiál a metody Kmen viru a buněčná linie

Kmen SARS CoV použitý v této studii je HKU39849. Plodové buňky opičích ledvin (FRhK-4) byly kultivovány v minimálním esenciálním médiu (MEM, Gibco, USA) s 10% fetálním telecím sérem a penicilinem se streptomycinem (Gibco, USA) při 37 °C a 5 % CO2 a byly použity pro pěstování zásobního viru a pro titraci virové infekčnosti .

2.2. Příprava zásobního viru

Zásobní virus byl sklizen, když se infekce přibližně 75 % buněčné monovrstvy baňky infikované virem projevila cytopatickým účinkem (CPE). Infikované buňky byly podrobeny jednomu cyklu zmrazení a rozmrazení, centrifugovány při 2000 otáčkách za minutu po dobu 20 minut, aby se odstranily zbytky buněk, a kultivační supernatant byl alikvotován a uchováván při -80 °C až do použití

2.3. Stanovení infekční dávky tkáňové kultury (50 %) (TCID50)

96jamkové mikrotitrační destičky obsahující 100 μl konfluentních FRhK-4 byly infikovány 100 μl sériových desetinásobných ředění zásobního viru v minimálním esenciálním médiu s 1 % FCS (udržovací médium) počínaje 10-1 až 108. Na těchto destičkách byla stanovena infekční dávka (50 %). Titrace byly provedeny ve čtyřech opakováních. Infikované buňky byly inkubovány 4 dny při 37 °C. Výskyt CPE byl zaznamenáván denně. TCID50 byla stanovena podle Reedovy a Muenchovy metody.

2.4. Vliv sušení, tepla a relativní vlhkosti

Deset mikrolitrů udržovacího média obsahujícího 107 TCID50 na ml viru bylo umístěno do jednotlivých jamek 24jamkových plastových destiček a nechalo se sušit při pokojové teplotě (22~25 °C) a relativní vlhkosti 40-50 % (tj. podmínky panující v typické klimatizované místnosti). Sto mikrolitrů MM bylo použito k resuspenzi viru v 0 h, 3 h, 7 h, 11 h, 13 h, 24 h a až 4 týdny a byla titrována zbytková infekčnost viru. Pokaždé byly zařazeny kontroly v uzavřené eppendorfské zkumavce se šroubovacím uzávěrem, se kterými bylo zacházeno podobně, ale bez sušení.

Pokus byl opakován při různých teplotách (38 °C, 33 °C, 28 °C) a relativní vlhkosti (>95 %, 80~89 %) po dobu 3 h, 7 h, 11 h, 13 h a 24 hodin. K vytvoření prostředí s vysokou a relativní nízkou vlhkostí byl použit rozprašovač za kontrolovaných podmínek. Všechny výše uvedené experimenty byly provedeny ve dvou opakováních a byla titrována zbytková virová infekčnost.

2.5. Test infekčnosti

Infekčnost zbytkového viru byla titrována ve čtyřech opakováních na mikrotitračních destičkách s 96 jamkami, které obsahovaly 100 μl konfluentních buněk FRhK-4. Do buněk FRhK-4 bylo přidáno 100 μl sériových desetinásobných ředění viru v udržovacím médiu, počínaje 10-1 až 108. Infikované buňky byly inkubovány při 37 °C po dobu 4 dnů. Výskyt CPE byl zaznamenáván denně. TCID50 byla stanovena podle metody Reeda a Muencha.

3. Výsledky

Deset mikrolitrů 107 TCID50 na ml viru bylo umístěno do jednotlivých jamek 24jamkové plastové destičky (představující neporézní povrch) a vysušeno. Vysušený virus byl poté inkubován při různých teplotách (38 °C, 33 °C, 28 °C) při různé relativní vlhkosti (>95 %, 80~89 %) po dobu 3 h, 7 h, 11 h, 13 h a 24 h a byla titrována zbytková virová infekčnost. Podobný experiment byl prováděn při pokojové teplotě a relativní vlhkosti přibližně 40-50 % (klimatizovaná místnost) po dobu až 4 týdnů. Virus vysušený na plastu si zachoval životaschopnost až 5 dní při 22~25 °C a relativní vlhkosti 40~50 % pouze se ztrátou titru (obrázek 1). Poté se infekčnost viru vždy postupně ztrácí. Ztráta infekčnosti viru v roztoku byla obecně podobná jako u sušeného viru za těchto podmínek prostředí. To naznačuje, že SARS CoV je stabilní virus, který může být potenciálně přenášen nepřímým kontaktem nebo fomity, zejména v klimatizovaném prostředí.

Obrázek 1

Zbytková infekčnost viru při 22-25 °C s relativní vlhkostí 40-50 % (počáteční titr 105/10 μl) a při 33 °C nebo 38 °C s relativní vlhkostí >95 %.

Vysoká relativní vlhkost (>95 %) při relativně nízké teplotě (28 °C a 33 °C) neměla na infekčnost viru významný vliv (obrázek 2 a)). Vysoká teplota (38 °C) při relativní vlhkosti 80-90 % vedla ke ztrátě titru o 0,25~2 po 24 hodinách (obrázek 2(b)). Pokud však byl vysušený virus skladován při vysoké teplotě (38 °C) a vysoké relativní vlhkosti (>95 %), došlo v porovnání s vysokou teplotou (38 °C) při nižší relativní vlhkosti 80-90 % k další ztrátě titru ~1,5 pro každý časový bod až do 24 h (0,38~3,38 ) (obrázky 3(a)-3(c)).

(a)

(b)

(a)
(b)

Obrázek 2

Infekčnost koronaviru SARS (105/10 μl) vůči různým teplotám při (a) >95% relativní vlhkosti, (b) >80-89%.

(a)

(b)

(c)

.
(a)
(b)
(c)

Obrázek 3

Infekčnost koronaviru SARS (počáteční titr 105/10 μl) při různé relativní vlhkosti při (a) 38 °C, (b) 33 °C a (c) 28 °C.

4. Diskuse

Viry se nereplikují mimo živou buňku, ale infekční virus může přetrvávat na kontaminovaných površích prostředí a doba přetrvávání životaschopného viru je výrazně ovlivněna teplotou a vlhkostí. Je známo, že kontaminované povrchy jsou významnými vektory při přenosu infekcí v nemocničním prostředí i v komunitě. Úloha fomitů při přenosu RSV byla jasně prokázána . Přežívání virů na různých fomitech bylo studováno u virů chřipky, paramyxovirů, poxvirů a retrovirů . Bylo zjištěno, že lidský koronavirus spojený s běžným nachlazením zůstává na površích v prostředí po vysušení životaschopný pouze 3 hodiny, ačkoli v tekuté suspenzi zůstává životaschopný po mnoho dní . Viry parainfluenzy a RSV byly po vysušení na površích životaschopné 2, resp. 6 hodin . V aerosolové formě je lidský koronavirus 229E obecně méně stabilní při vysoké vlhkosti . Stabilita SCoV v prostředí nebyla dosud známa a tato informace je zjevně důležitá pro pochopení mechanismů přenosu tohoto viru v nemocničním a komunitním prostředí.

V této studii jsme prokázali, že SARS CoV může přežívat nejméně dva týdny po vysušení za teplotních a vlhkostních podmínek, které se vyskytují v klimatizovaném prostředí. Virus je stabilní po dobu 3 týdnů při pokojové teplotě v tekutém prostředí, ale je snadno usmrcen teplem při 56 °C po dobu 15 minut . To naznačuje, že SARS CoV je stabilní virus, který může být potenciálně přenášen nepřímým kontaktem nebo fomity. Tyto výsledky mohou naznačovat, že kontaminované povrchy mohou hrát hlavní roli při přenosu infekce v nemocnici a v komunitě.

Naše studie ukazují, že SCoV je relativně stabilnější než lidské koronaviry 229E nebo OC43 a některé další virové respirační patogeny, jako je respirační syncytiální virus. Tato zjištění naznačují, že zatímco přímý přenos kapénkami je důležitou cestou přenosu , významnou roli při přenosu viru mohou hrát fomity a kontaminace prostředí. Zejména fomity mohou přispívat k pokračujícímu přenosu infekce v nozokomiálním prostředí, ke kterému stále dochází navzdory velké pozornosti a přísným opatřením přijatým k prevenci šíření kapénkami. Kromě kapénkových preventivních opatření je třeba posílit kontaktní preventivní opatření a mytí rukou.

Fekální kontaminace koronavirem SCoV tak může být účinnou cestou přenosu onemocnění. Epidemie v Amoy Garden v Hongkongu, která postihla více než 300 obyvatel v jednobytovém bloku s předpokládá, že byla přenesena kontaminovanými odpadními vodami. Stabilita viru na povrchu prostředí a jeho přítomnost ve výkalech naznačuje, že fekální kontaminace produkce čerstvých potravin může představovat hrozbu pro přenos viru; zejména v zemích se špatnými hygienickými podmínkami a systémy likvidace odpadních vod a že je třeba provést studie, které by se touto možností zabývaly.

V této studii jsme prokázali, že vysoká teplota při vysoké relativní vlhkosti má synergický účinek na inaktivaci životaschopnosti viru SARS CoV, zatímco nižší teploty a nízká vlhkost podporují prodloužené přežívání viru na kontaminovaných površích. Podmínky prostředí v zemích, jako je Malajsie, Indonésie a Thajsko, tedy nejsou příznivé pro prodloužené přežívání viru. V zemích, jako je Singapur a Hongkong, kde se intenzivně používá klimatizace, došlo k přenosu viru převážně v dobře klimatizovaném prostředí, jako jsou nemocnice nebo hotely. Samostatná studie dále ukázala, že během epidemie bylo riziko zvýšeného denního výskytu SARS 18,18krát vyšší ve dnech s nižší teplotou vzduchu než ve dnech s vyšší teplotou v Hongkongu a dalších regionech . Souhrnně mohou tato pozorování vysvětlit, proč v některých asijských zemích v tropické oblasti (s vysokou teplotou při vysoké relativní vlhkosti vzduchu), jako je Malajsie, Indonésie a Thajsko, nedošlo k nozokomiálnímu výskytu SARS (tabulky 1 a 2 a)-2 c)). To může také vysvětlovat, proč v Singapuru, který se rovněž nachází v tropické oblasti (tabulka 2(d)), byla většina ohnisek SARS v nemocnicích (klimatizované prostředí). Zajímavé je, že během propuknutí SARS v Kantonu měli lékaři otevřená okna v pokojích pacientů a dobře je větrali, což mohlo snížit přežívání viru a tím i nozokomiální přenos. Virus SARS CoV si může udržet svou infekčnost až 2 týdny v prostředí s nízkou teplotou a vlhkostí, což by mohlo usnadnit přenos viru v komunitě jako v Hongkongu, který se nachází v subtropické oblasti (tabulka 2 e)). Je třeba vzít v úvahu i další faktory prostředí, včetně rychlosti větru, denního slunečního záření a tlaku vzduchu, u nichž se ukázalo, že souvisejí s epidemií SARS. Dynamika epidemie SARS zahrnuje více faktorů včetně fyzikálních vlastností viru, venkovního a vnitřního prostředí, hygieny, prostoru a genetických predispozic . Pochopení stability virů v různých teplotních a vlhkostních podmínkách je důležité pro pochopení přenosu nového infekčního agens včetně nedávné chřipkové apandemie H1N12009.

Střet zájmů

Autoři prohlašují, že nejsou ve střetu zájmů.

.