Contig kann sich auch auf die überlappenden Klone beziehen, die eine physische Karte eines Chromosoms bilden, wenn die Top-down- oder hierarchische Sequenzierungsstrategie verwendet wird. Bei dieser Sequenzierungsmethode wird vor der Sequenzierung eine niedrig aufgelöste Karte erstellt, um einen Rahmen für die spätere Zusammenstellung der Sequenzlesungen des Genoms zu schaffen. Diese Karte gibt die relativen Positionen und Überlappungen der für die Sequenzierung verwendeten Klone an. Gruppen sich überlappender Klone, die einen zusammenhängenden DNA-Abschnitt bilden, werden als Contigs bezeichnet; die Mindestanzahl von Klonen, die einen Contig bilden, der das gesamte Chromosom abdeckt, bilden den Tiling Path, der für die Sequenzierung verwendet wird. Sobald ein Tiling Path ausgewählt wurde, werden die einzelnen BACs in kleinere Fragmente zerlegt und sequenziert. Contigs bilden daher den Rahmen für die hierarchische Sequenzierung. Der Aufbau einer Contig-Karte umfasst mehrere Schritte. Zunächst wird die DNA in größere Stücke (50-200kb) zerlegt, die in BACs oder PACs geklont werden, um eine BAC-Bibliothek zu bilden. Da diese Klone das gesamte Genom/Chromosom abdecken sollten, ist es theoretisch möglich, eine Kontig-Karte aus BACs zusammenzustellen, die das gesamte Chromosom abdeckt. Die Realität ist jedoch nicht immer ideal. Oft bleiben Lücken, und ein Gerüst aus Contigs und Lücken, das die Kartenregion abdeckt, ist oft das erste Ergebnis. Die Lücken zwischen Contigs können durch verschiedene Methoden geschlossen werden, die im Folgenden beschrieben werden.
Konstruktion von BAC-ContigsBearbeiten
BAC-Contigs werden durch das Alignment von BAC-Regionen mit bekannter Überlappung mittels verschiedener Methoden konstruiert. Eine gängige Strategie ist die Verwendung von STS (Sequence-Tagged Site Content Mapping), um einzigartige gemeinsame DNA-Stellen zwischen BACs zu ermitteln. Der Grad der Überlappung wird grob anhand der Anzahl der STS-Marker geschätzt, die zwei Klone gemeinsam haben, wobei mehr gemeinsame Marker eine größere Überlappung bedeuten. Da diese Strategie nur eine sehr grobe Schätzung der Überlappung liefert, wird häufig eine Restriktionsverdauungsfragmentanalyse verwendet, die eine genauere Messung der Klonüberlappung ermöglicht. Bei dieser Strategie werden die Klone mit einem oder zwei Restriktionsenzymen behandelt und die resultierenden Fragmente durch Gelelektrophorese getrennt. Wenn es sich um zwei Klone handelt, haben sie wahrscheinlich gemeinsame Restriktionsstellen und somit auch mehrere Fragmente. Da die Anzahl der gemeinsamen Fragmente und die Länge dieser Fragmente bekannt ist (die Länge wird durch Vergleich mit einem Größenstandard bestimmt), kann der Grad der Überlappung mit einem hohen Maß an Präzision abgeleitet werden.
Lücken zwischen ContigsEdit
Nach der anfänglichen BAC-Contig-Konstruktion bleiben oft Lücken. Diese Lücken treten auf, wenn die untersuchte BAC-Bibliothek (Bacterial Artificial Chromosome) eine geringe Komplexität aufweist, d. h. sie enthält keine große Anzahl von STS- oder Restriktionsstellen, oder wenn bestimmte Regionen in Klonierungswirten weniger stabil waren und daher in der Bibliothek unterrepräsentiert sind. Wenn nach dem STS-Landmark-Mapping und dem Restriktions-Fingerprinting Lücken zwischen den Contigs verbleiben, kann die Sequenzierung der Contig-Enden verwendet werden, um diese Lücken zu schließen. Mit dieser Endsequenzierungsstrategie wird im Wesentlichen eine neue STS geschaffen, mit der die anderen Contigs gescreent werden können. Alternativ kann die Endsequenz eines Contigs als Primer verwendet werden, um die Lücke zu überbrücken.