A contig utalhat azokra az egymást átfedő klónokra is, amelyek egy kromoszóma fizikai térképét alkotják, amikor a top-down vagy hierarchikus szekvenálási stratégiát használják. Ennél a szekvenálási módszernél a szekvenálás előtt alacsony felbontású térképet készítenek, hogy keretet adjanak a genom szekvenciaolvasatainak későbbi összeállításához. Ez a térkép azonosítja a szekvenáláshoz használt klónok relatív pozícióit és átfedéseit. Az egybefüggő DNS-szakaszt alkotó, egymást átfedő klónok csoportjait kontigoknak nevezzük; a teljes kromoszómát lefedő kontigot alkotó klónok minimális száma alkotja a szekvenáláshoz használt csempézési útvonalat. Miután kiválasztásra került egy tiling path, az azt alkotó BAC-ket kisebb fragmentumokra vágjuk és szekvenáljuk. A kontigok adják tehát a hierarchikus szekvenálás keretét.A kontig-térkép összeállítása több lépést foglal magában. Először a DNS-t nagyobb (50-200 kb) darabokra vágják, amelyeket BAC-okba vagy PAC-okba klónoznak, hogy BAC-könyvtárat alkossanak. Mivel ezeknek a klónoknak le kell fedniük a teljes genomot/kromoszómát, elméletileg lehetséges a teljes kromoszómát lefedő BAC-kontig összeállítani. A valóság azonban nem mindig ideális. Gyakran maradnak hézagok, és az első eredmény gyakran egy olyan – kontigokból és hézagokból álló – állványzat, amely lefedi a térkép régióját. A kontigok közötti hézagok az alábbiakban ismertetett különböző módszerekkel zárhatók.
BAC-kontigok szerkesztéseSzerkesztés
A BAC-kontigok szerkesztése ismert átfedésű BAC-régiók különböző módszerekkel történő összehangolásával történik. Az egyik gyakori stratégia a szekvencia-jelölésű helyek (STS) tartalmi feltérképezése a BAC-ok között közös egyedi DNS-helyek felderítésére. Az átfedés mértékét nagyjából a két klón közötti közös STS-markerek számával lehet megbecsülni, a több közös marker nagyobb átfedést jelent. Mivel ez a stratégia csak nagyon durva becslést ad az átfedésről, gyakran alkalmazzák a restrikciós emésztési fragmentumelemzést, amely a klónok átfedésének pontosabb mérését teszi lehetővé. Ennél a stratégiánál a klónokat egy vagy két restrikciós enzimmel kezelik, és a kapott fragmentumokat gélelektroforézissel választják szét. Ha két klónról van szó, akkor azok valószínűleg rendelkeznek közös restrikciós helyekkel, és így több fragmentumon is osztoznak. Mivel a közös fragmentumok száma és hossza ismert (a hosszúságot egy méretszabvánnyal való összehasonlítással határozzák meg), az átfedés mértéke nagy pontossággal meghatározható.
Hézagok a kontigok közöttSzerkesztés
A kezdeti BAC-kontigkonstrukció után gyakran maradnak hézagok. Ezek a hiányosságok akkor fordulnak elő, ha a szűrt Bakteriális Mesterséges Kromoszóma (BAC) könyvtár alacsony komplexitású, azaz nem tartalmaz nagyszámú STS- vagy restrikciós helyet, vagy ha bizonyos régiók kevésbé stabilak voltak a klónozó gazdaszervezetekben, és ezért alulreprezentáltak a könyvtárban. Ha a kontigok közötti hézagok az STS-pontok feltérképezése és a restrikciós ujjlenyomatok meghatározása után is fennmaradnak, a kontigvégek szekvenálása felhasználható e hézagok megszüntetésére. Ez a végszekvenálási stratégia lényegében egy új STS-t hoz létre, amellyel a többi kontigot szűrni lehet. Alternatív megoldásként a kontig végszekvenciája primerként használható a hézagok átjárásához.