Contig

Contig voi viitata myös päällekkäisiin klooneihin, jotka muodostavat kromosomin fyysisen kartan, kun käytetään top-down- tai hierarkkista sekvensointistrategiaa. Tässä sekvensointimenetelmässä matalaresoluutioinen kartta tehdään ennen sekvensointia, jotta saadaan kehys, joka ohjaa genomin sekvenssilukujen myöhempää kokoamista. Tämä kartta määrittää sekvensoinnissa käytettävien kloonien suhteelliset sijainnit ja päällekkäisyydet. Päällekkäisten kloonien joukot, jotka muodostavat yhtenäisen DNA-jakson, ovat niin sanottuja contigeja; koko kromosomin kattavan contigin muodostavien kloonien vähimmäismäärä muodostaa sekvensoinnissa käytettävän laatoitusreitin. Kun tiling-polku on valittu, sen sisältämät BAC-kappaleet leikataan pienempiin fragmentteihin ja sekvensoidaan. Kontigit tarjoavat näin ollen puitteet hierarkkiselle sekvensoinnille.Kontigikartan kokoamiseen kuuluu useita vaiheita. Ensin DNA leikataan suuremmiksi (50-200 kb) paloiksi, jotka kloonataan BAC:iin tai PAC:iin BAC-kirjaston muodostamiseksi. Koska näiden kloonien pitäisi kattaa koko genomi/kromosomi, on teoreettisesti mahdollista koota koko kromosomin kattava BAC-kontigi. Todellisuus ei kuitenkaan aina ole ihanteellinen. Aukkoja jää usein jäljelle, ja ensimmäisenä tuloksena on usein kontigien ja aukkojen muodostama teline, joka kattaa kartta-alueen. Kontigien väliset aukot voidaan sulkea jäljempänä esitetyillä eri menetelmillä.

BAC-kontigien rakentaminen Muokkaa

BAC-kontigit rakennetaan sovittamalla yhteen BAC-alueet, joiden päällekkäisyys on tiedossa, useilla eri menetelmillä. Yksi yleinen strategia on käyttää STS-sisältökartoitusta (sequence-tagged site) havaitsemaan ainutlaatuisia DNA-kohtia, jotka ovat yhteisiä BAC:ien välillä. Päällekkäisyyden aste arvioidaan karkeasti kahden kloonin yhteisten STS-markkerien lukumäärän perusteella, jolloin useampi yhteinen markkeri merkitsee suurempaa päällekkäisyyttä. Koska tämä strategia antaa vain hyvin karkean arvion päällekkäisyydestä, käytetään usein restriktiosulatusfragmenttianalyysiä, jolla kloonien päällekkäisyys voidaan mitata tarkemmin. Tässä strategiassa kloonit käsitellään yhdellä tai kahdella restriktioentsyymillä ja näin saadut fragmentit erotetaan geelielektroforeesilla. Jos on kaksi kloonia, niillä on todennäköisesti yhteisiä restriktiokohtia ja siten useita yhteisiä fragmentteja. Koska yhteisten fragmenttien määrä ja niiden pituus tunnetaan (pituus arvioidaan vertaamalla sitä kokostandardiin), päällekkäisyyden aste voidaan päätellä suurella tarkkuudella.

Kontigien väliset aukot Muokkaa

Kontigien välille jää usein aukkoja alkuperäisen BAC-kontigin rakentamisen jälkeen. Näitä aukkoja syntyy, jos seulottu BAC-kirjasto (Bacterial Artificial Chromosome, bakteeriperäinen keinotekoinen kromosomi) on vähän monimutkainen, mikä tarkoittaa, että se ei sisällä suurta määrää STS- tai restriktiokohtia, tai jos tietyt alueet eivät ole olleet yhtä vakaita kloonausisännissä ja ovat siten aliedustettuina kirjastossa. Jos contigien välille jää aukkoja sen jälkeen, kun STS-maamerkkikartoitus ja restriktiosormenjälki on suoritettu, contigien päiden sekvensointia voidaan käyttää näiden aukkojen täyttämiseen. Tämä lopun sekvensointistrategia luo periaatteessa uuden STS:n, jonka avulla voidaan seuloa muut kontigit. Vaihtoehtoisesti contigin loppusekvenssiä voidaan käyttää alukkeena aukon ylittämiseen.

Jätä kommentti