Contig kan också referera till de överlappande kloner som bildar en fysisk karta över en kromosom när top-down- eller hierarkisk sekvenseringsstrategi används. I denna sekvenseringsmetod görs en karta med låg upplösning före sekvenseringen för att skapa en ram för att vägleda den senare sammansättningen av sekvensläsningarna av genomet. Denna karta identifierar de relativa positionerna och överlappningen av de kloner som används för sekvensering. Satser av överlappande kloner som bildar en sammanhängande DNA-sträcka kallas contigs; det minsta antalet kloner som bildar en contig som täcker hela kromosomen utgör den kakelbana som används för sekvensering. När en tiling path väl har valts ut, skärs de ingående BAC:erna i mindre fragment och sekvenseras. Contigs utgör därför ramen för hierarkisk sekvensering.Sammanställningen av en contig-karta omfattar flera steg. Först skärs DNA till större bitar (50-200 kb) som klonas in i BACs eller PACs för att bilda ett BAC-bibliotek. Eftersom dessa kloner bör täcka hela genomet/kromosomen är det teoretiskt möjligt att sammanställa en kontig av BACs som täcker hela kromosomen. Verkligheten är dock inte alltid idealisk. Det finns ofta luckor kvar, och det första resultatet är ofta en scaffold – bestående av contigs och luckor – som täcker kartområdet. Luckorna mellan contigs kan stängas med olika metoder som beskrivs nedan.
Konstruktion av BAC contigsEdit
BAC contigs konstrueras genom att BAC-regioner med känd överlappning anpassas med hjälp av en rad olika metoder. En vanlig strategi är att använda kartläggning av sekvensmärkta platser (STS) för att upptäcka unika DNA-platser som är gemensamma mellan BAC:er. Graden av överlappning uppskattas grovt av antalet STS-markörer som är gemensamma mellan två kloner, där fler gemensamma markörer innebär en större överlappning. Eftersom denna strategi endast ger en mycket grov uppskattning av överlappningen används ofta restriktionsförstörelsefragmentanalys, som ger en mer exakt mätning av klonöverlappningen. I denna strategi behandlas kloner med ett eller två restriktionsenzymer och de resulterande fragmenten separeras genom gelelektrofores. Om två kloner har restriktionsställen gemensamt kommer de sannolikt att ha flera fragment gemensamt. Eftersom antalet gemensamma fragment och längden på dessa fragment är kända (längden bedöms genom jämförelse med en storleksstandard) kan graden av överlappning härledas med hög precision.
Luckor mellan contigsRedigera
Luckor kvarstår ofta efter den första konstruktionen av BAC-contigs. Dessa luckor uppstår om det undersökta BAC-biblioteket (Bacterial Artificial Chromosome) har låg komplexitet, vilket innebär att det inte innehåller ett stort antal STS- eller restriktionsställen, eller om vissa regioner var mindre stabila i kloningsvärdar och därmed underrepresenterade i biblioteket. Om luckor mellan contigs kvarstår efter det att kartläggning av STS-landmärken och fingeravtryck av restriktionsställen har utförts, kan sekvensering av contigs ändar användas för att täppa till dessa luckor. Denna strategi för sekvensering av ändar skapar i princip en ny STS som kan användas för att undersöka de andra kontigarna. Alternativt kan slutsekvensen av en contig användas som en primer för att gå över gapet.