Contig también puede referirse a los clones superpuestos que forman un mapa físico de un cromosoma cuando se utiliza la estrategia de secuenciación descendente o jerárquica. En este método de secuenciación, se realiza un mapa de baja resolución antes de la secuenciación con el fin de proporcionar un marco que guíe el posterior ensamblaje de las lecturas de la secuencia del genoma. Este mapa identifica las posiciones relativas y el solapamiento de los clones utilizados para la secuenciación. Los conjuntos de clones superpuestos que forman un tramo contiguo de ADN se denominan contigs; el número mínimo de clones que forman un contig que cubre todo el cromosoma comprende la ruta de mosaico que se utiliza para la secuenciación. Una vez que se ha seleccionado una ruta de mosaico, los BAC que la componen se dividen en fragmentos más pequeños y se secuencian. Por lo tanto, los contigs proporcionan el marco para la secuenciación jerárquica.El montaje de un mapa de contigs implica varios pasos. En primer lugar, el ADN se corta en fragmentos más grandes (50-200kb), que se clonan en BACs o PACs para formar una biblioteca de BACs. Dado que estos clones deberían cubrir todo el genoma/cromosoma, es teóricamente posible ensamblar un contig de BACs que cubra todo el cromosoma. Sin embargo, la realidad no siempre es ideal. A menudo quedan huecos, y un andamio -compuesto por contigs y huecos- que cubre la región del mapa suele ser el primer resultado. Los huecos entre contigs pueden cerrarse mediante varios métodos que se describen a continuación.
Construcción de contigs de BACEditar
Los contigs de BAC se construyen alineando regiones de BAC de solapamiento conocido mediante una variedad de métodos. Una estrategia común es utilizar el mapeo del contenido de los sitios marcados por la secuencia (STS) para detectar sitios de ADN únicos en común entre los BAC. El grado de solapamiento se estima a grandes rasgos por el número de marcadores STS en común entre dos clones, y un mayor número de marcadores en común significa un mayor solapamiento. Dado que esta estrategia sólo proporciona una estimación muy aproximada del solapamiento, a menudo se utiliza el análisis de fragmentos de digestión de restricción, que proporciona una medida más precisa del solapamiento de los clones. En esta estrategia, los clones se tratan con una o dos enzimas de restricción y los fragmentos resultantes se separan mediante electroforesis en gel. Si hay dos clones, es probable que tengan sitios de restricción en común y, por tanto, que compartan varios fragmentos. Dado que se conoce el número de fragmentos en común y la longitud de estos fragmentos (la longitud se juzga por comparación con un estándar de tamaño), el grado de solapamiento puede deducirse con un alto grado de precisión.
Lagunas entre contigsEditar
A menudo quedan lagunas tras la construcción inicial de contigs de BAC. Estas lagunas se producen si la biblioteca de cromosomas artificiales bacterianos (BAC) seleccionada tiene una complejidad baja, lo que significa que no contiene un número elevado de STS o sitios de restricción, o si ciertas regiones eran menos estables en los huéspedes de clonación y, por tanto, estaban poco representadas en la biblioteca. Si quedan huecos entre contigs después de realizar el mapeo de puntos de referencia STS y la huella de restricción, se puede utilizar la secuenciación de los extremos de los contigs para cerrar estos huecos. Esta estrategia de secuenciación de los extremos crea esencialmente una nueva STS con la que examinar los demás contigs. Alternativamente, la secuencia final de un contig puede usarse como cebador para recorrer la brecha.