自分の組織に最適な固定剤を見つけたと思った矢先、他に考慮すべきことがあります-固定剤が、新しい抗体が結合するはずだったすべての抗原部位を隠してしまったのかもしれません！
抗原を隠してしまったのでしょうか。
Don’t worry – help is at hand!
抗原のマスキングは、エピトープ内のアミノ酸の架橋だけでなく、エピトープやその近傍の無関係なペプチドの架橋、エピトープの構造の変化、抗原の静電気の変化によっても起こることがあります。 抗原抗体認識はタンパク質の構造に依存しているため、自然な3次元構造の復元を試みることが重要である。
マスクを外す！
抗体によっては、マスクを外す必要がないものもありますが、そのような場合でも、慌てないでください。 抗原賦活化とは、エピトープのマスキングを解除し、エピトープと抗体の結合を回復させる技術のことをいいます。 抗原賦活法の種類は、標的抗原、使用する抗体、組織の種類、組織保存のための固定方法など、多くの変数によって決まります。 例えば、複数のエピトープを認識するポリクローナル抗体を使用する場合、抗原回収を必要とする可能性は低くなりますが、バックグラウンドが少し増える可能性があります。 エタノールなどの固定法を用いた場合は、固定が十分でなく、検索条件に対応できない可能性があるため、抗原検索はお勧めできません。
熱か酵素か-選ぶなら
エピトープの免疫反応を回復する技術は複数あり、一般的には、(a)酵素による抗原検索、(b)熱による抗原検索に大別されます。
酵素を用いる方法
酵素を用いる方法では、Proteinase K、Trypsin、Pepsinなどの酵素を用いて、抗体のエピトープへの結合を回復させることができる。 作用機序としては、エピトープをマスキングしている可能性のあるペプチドの切断が考えられている。 37?Cで10～20分のインキュベーションを必要とする主な酵素誘導法は以下の通りです：
- Proteinase K (20 g/ml in TE buffer, pH 8)
- Trypsin (0.5% in dH20)
- Pepsin (0.1% in 10 mM HCl)
- Pronase (0.5 or 0.1 in 10 mM HCl)Proteinase (0.5% in dH20)
- Trypsin (0.5% in dH20)
- Trypsin (0.5% in dH20)1% in dH20)
- Protease (0.5% in dH20)
どの方法を選択するかによって、組織型や抗体の違いによってそれぞれ最適化しなければならないが、ブロッキング前と脱脂ステップ後にそれぞれの方法の枠を設ける。 これらの方法の欠点は、免疫反応性を回復させる成功率が低いことと、組織の形態と目的の抗原の両方を破壊する可能性があることです。
酵素による方法が少し過酷すぎる、あるいは単にうまくいかないと感じる場合は、熱による方法を試してみることができます。 この方法では、いくつかの架橋を逆転させ、エピトープの二次構造または三次構造を復元することができると考えられています。
熱による方法
これは、熱源からの熱エネルギーによってプロセス全体が駆動され、ホルマリン誘発の架橋を加水分解（破壊）する可能性があります。 酵素誘導法と同様に、熱誘導法も最適化が必要である。 これらの方法は、蒸し器、電子レンジ（5分刻み）、または95～100℃の水浴で10～40分、その後室温で20分冷却する必要があります：
- クエン酸緩衝液（10 mMクエン酸ナトリウム, 0.05% Tween 20, pH 6）
- クエン酸-EDTA緩衝液（10 mMクエン酸ナトリウム、2 mM EDTA, 0.05% Tween 20, pH 6.2)
- EDTA (1 mM EDTA, 0.05% Tween 20, pH 8)
- Tris-EDTA (10 mM Tris Base, 1 mM EDTA, 0.05% Tween 20, pH 9)
- Glycine-EDTA (50 mM Glycine-HCl, 0.05% Tween 20))
- Glycine-HCl (10 mM Tris, 0.05% Twin 20, pH 9)
- Tris-EDTA (1mM EDTA, 0.05% Twin 20, pH 8)01% EDTA, pH 3.5)
一般的には、熱による方法の方が成功率が高いためか、広く使用されているようです。 もし、これから抗原賦活を始めるのであれば、まずはクエン酸緩衝液による賦活を試してみるのがよいでしょう。 もちろん、それがうまくいかなければ、その後にいくらでも試すことができます。