Când credeți că ați găsit fixatorul perfect pentru țesutul dumneavoastră, mai este ceva de luat în considerare – este posibil ca fixatorul dumneavoastră să fi mascat toate situsurile antigenice la care urma să se lege minunatul dumneavoastră anticorp!
Ați mascat antigenul?
Așa cum am menționat într-unul din articolele mele anterioare, tehnica de fixare pe care ați ales-o creează de obicei legături încrucișate în proteine; acesta este unul dintre modurile în care țesutul este stabilizat. Acest lucru poate modifica biochimia proteinei astfel încât antigenul de interes să fie mascat și să nu mai fie recunoscut de anticorpul dvs. primar.
Nu vă faceți griji – ajutorul este la îndemână!
Mascarea antigenului poate fi cauzată nu numai de reticulația aminoacizilor din cadrul epitopului, ci și de reticulația peptidelor neînrudite la sau în apropierea unui epitop, de modificarea conformației unui epitop sau de modificarea sarcinii electrostatice a antigenului. Deoarece recunoașterea antigen-anticorp se bazează pe structura proteică, este important să se încerce restabilirea structurii 3-D naturale. Nu vă faceți griji- există o serie de tehnici disponibile pentru a trece peste acest lucru.
Îndepărtați-vă masca!
Câțiva anticorpi nu necesită nici un fel de demascare, dar dacă al dvs. o face, nu intrați în panică- este doar un scurt adaos la protocolul dvs. obișnuit. Termenul de recuperare a antigenului se referă la orice tehnică în care mascarea unui epitop este inversată și se restabilește legătura epitop-anticorp. Tipul de recuperare a antigenului depinde de multe variabile care includ antigenul țintă, anticorpul utilizat, tipul de țesut și metoda de fixare utilizată pentru conservarea țesutului dumneavoastră. De exemplu, dacă folosiți un anticorp policlonal, care recunoaște mai mulți epitopi, este mai puțin probabil să fie necesară recuperarea antigenului, dar este, de asemenea, probabil să aibă un pic de fond suplimentar. Dacă ați folosit o tehnică de fixare, cum ar fi etanolul, atunci recuperarea antigenului nu este recomandată, deoarece este posibil ca fixarea să nu fie suficient de puternică pentru a face față condițiilor de recuperare.
Căldura sau enzimele- tu alegi
Există mai multe tehnici pentru a restabili imunoreactivitatea unui epitop și acestea se împart, în general, în două categorii principale; (a) recuperarea antigenului indusă de enzime și (b) recuperarea antigenului indusă de căldură. De asemenea, în cadrul fiecărei categorii există un număr de moduri diferite de a face recuperarea.
Metode induse de enzime
În metodele induse de enzime, enzimele, inclusiv proteinaza K, tripsina și pepsina, pot fi utilizate pentru a restabili legătura unui anticorp cu epitopul său. Se crede că mecanismul de acțiune este reprezentat de scindarea peptidelor care pot masca epitopul. Principalele metode induse de enzime, care necesită o incubare de 10-20 de minute la 37?C, sunt:
- Proteinaza K (20 g/ml în tampon TE, pH 8)
- Trippsina (0,5% în dH20)
- Pepsina (0,1% în 10 mM HCl)
- Pronaza (0,5 sau 0.1% în dH20)
- Protează (0,5% în dH20)
În funcție de metoda pe care o alegeți, fiecare trebuie să fie optimizată pentru diferite tipuri de țesuturi și anticorpi, dar fiecare dintre aceste metode se strecoară înainte de blocare și după etapele de deparafinare. Dezavantajele acestor metode sunt rata scăzută de succes pentru restabilirea imunoreactivității și potențialul de distrugere atât a morfologiei țesutului, cât și a antigenului de interes.
Dacă vi se pare că metoda indusă de enzime este puțin prea dură sau că pur și simplu nu funcționează pentru dumneavoastră, atunci puteți încerca metoda indusă de căldură. Se crede că această metodă inversează unele legături încrucișate și permite restabilirea structurii secundare sau terțiare a epitopului. Este, în esență, o re-naturare a structurii proteinelor fixate printr-o serie de modificări conformaționale.
Metode induse de căldură
Aceasta poate include posibila hidroliză (rupere) a legăturilor încrucișate induse de formalină, întregul proces fiind condus de energia termică de la sursa de căldură. Ca și în cazul metodelor induse de enzime, metodele induse de căldură necesită optimizare. Aceste metode, care necesită 10-40 de minute într-un abur, cuptor cu microunde (în trepte de cinci minute) sau baie de apă la 95-100?C, urmate de 20 de minute de răcire la temperatura camerei sunt:
- Buffer citrat (10 mM citrat de sodiu, 0,05% Tween 20, pH 6)
- Buffer citrat-EDTA (10 mM citrat de sodiu, 2 mM EDTA, 0,05% Tween 20, pH 6)
- Buffer citrat-EDTA (10 mM citrat de sodiu, 2 mM EDTA, 0,05% Tween 20, pH 6).05% Tween 20, pH 6,2)
- EDTA (1 mM EDTA, 0,05% Tween 20, pH 8)
- Tris-EDTA (10 mM bază Tris, 1 mM EDTA, 0,05% Tween 20, pH 9)
- Glicină-EDTA (50 mM Glicină-HCl, 0,05% Tween 20, pH 9)
- Glicină-EDTA (50 mM Glicină-HCl, 0.01% EDTA, pH 3,5)
În general, metodele induse de căldură sunt mai utilizate pe scară largă, probabil pentru că au mai mult succes. Dacă sunteți la început cu recuperarea antigenului, atunci un bun punct de plecare ar fi metoda încercată și testată a recuperării cu tampon citrat. Desigur, dacă nu funcționează, atunci aveți multe de încercat ulterior.
V-a ajutat acest lucru? Atunci vă rugăm să împărtășiți cu rețeaua dumneavoastră.