Proprio quando pensi di aver trovato il fissativo perfetto per il tuo tessuto, c’è qualcos’altro da considerare: il tuo fissativo potrebbe aver appena mascherato tutti i siti antigenici a cui il tuo nuovo anticorpo avrebbe dovuto legarsi!
Hai appena mascherato il tuo antigene?
Come ho detto in uno dei miei articoli precedenti, la tecnica di fissazione che hai scelto di solito crea legami incrociati all’interno delle proteine; questo è uno dei modi in cui il tessuto viene stabilizzato. Questo può alterare la biochimica della proteina in modo tale che l’antigene di interesse è mascherato e non sarà più riconosciuto dal tuo anticorpo primario.
Non preoccuparti- l’aiuto è a portata di mano!
Il mascheramento dell’antigene può essere causato non solo da cross-linking degli aminoacidi all’interno dell’epitopo, ma anche da cross-linking di peptidi non correlati a o vicino a un epitopo, alterando la conformazione di un epitopo, o alterando la carica elettrostatica dell’antigene. Poiché il riconoscimento antigene-anticorpo si basa sulla struttura della proteina, è importante cercare di ripristinare la struttura 3-D naturale. Non preoccupatevi, ci sono diverse tecniche disponibili per superare questo problema.
Rimuovi la maschera!
Alcuni anticorpi non richiedono alcun tipo di smascheramento, ma se il vostro lo richiede, niente panico, è solo una breve aggiunta al vostro solito protocollo. Il termine antigen retrieval si riferisce a qualsiasi tecnica in cui il mascheramento di un epitopo viene invertito e il legame epitopo-anticorpo viene ripristinato. Il tipo di recupero dell’antigene dipende da molte variabili che includono l’antigene target, l’anticorpo usato, il tipo di tessuto e il metodo di fissazione usato per conservare il tessuto. Per esempio, se stai usando un anticorpo policlonale, che riconosce più epitopi, è meno probabile che richieda il recupero dell’antigene, ma è anche probabile che abbia un po’ di background in più. Se hai usato una tecnica di fissazione come l’etanolo, allora il recupero dell’antigene non è raccomandato perché la fissazione potrebbe non essere abbastanza forte da gestire le condizioni di recupero.
Calore o enzimi – scegli tu
Ci sono molteplici tecniche per ripristinare l’immunoreattività di un epitopo e queste generalmente rientrano in due categorie principali; (a) recupero dell’antigene indotto da enzimi e (b) recupero dell’antigene indotto dal calore. Inoltre, all’interno di ogni categoria ci sono un certo numero di modi diversi per fare il recupero.
Metodi indotti da enzimi
Nei metodi indotti da enzimi, gli enzimi tra cui Proteinasi K, Tripsina e Pepsina possono essere utilizzati per ripristinare il legame di un anticorpo al suo epitopo. Si pensa che il meccanismo d’azione sia la scissione dei peptidi che possono mascherare l’epitopo. I principali metodi enzimatici, che richiedono un’incubazione di 10-20 minuti a 37°C, sono:
- Proteinasi K (20 g/ml in tampone TE, pH 8)
- Tripsina (0,5% in dH20)
- Pepsina (0,1% in 10 mM HCl)
- Pronasi (0,5 o 0.1% in dH20)
- Proteasi (0,5% in dH20)
A seconda del metodo scelto, ognuno deve essere ottimizzato per diversi tipi di tessuto e anticorpi, ma ognuno di questi metodi si inserisce prima del blocco e dopo le fasi di deceratura. Gli svantaggi di questi metodi sono il basso tasso di successo per il ripristino dell’immunoreattività e il potenziale per distruggere sia la morfologia del tessuto che l’antigene di interesse.
Se trovate il metodo indotto dagli enzimi un po’ troppo duro, o che semplicemente non funziona per voi, allora potete provare il metodo indotto dal calore. Si ritiene che questo metodo inverta alcuni legami incrociati e permetta il ripristino della struttura secondaria o terziaria dell’epitopo. Si tratta, in sostanza, di una rinaturazione della struttura delle proteine fissate attraverso una serie di cambiamenti conformazionali.
Metodi indotti dal calore
Questo può includere la possibile idrolisi (rottura) dei crosslink indotti dalla formalina con l’intero processo guidato dall’energia termica della fonte di calore. Come per i metodi indotti dagli enzimi, i metodi indotti dal calore richiedono un’ottimizzazione. Questi metodi, che richiedono 10-40 minuti in un vaporizzatore, microonde (incrementi di cinque minuti) o bagno d’acqua a 95-100?C seguito da 20 minuti di raffreddamento a temperatura ambiente sono:
- Tampone citrato (10 mM Sodium Citrate, 0,05% Tween 20, pH 6)
- Tampone Citrato-EDTA (10 mM Sodium Citrate, 2 mM EDTA, 0.05% Tween 20, pH 6.2)
- EDTA (1 mM EDTA, 0.05% Tween 20, pH 8)
- Tris-EDTA (10 mM Tris Base, 1 mM EDTA, 0.05% Tween 20, pH 9)
- Glicina-EDTA (50 mM Glicina-HCl, 0.01% EDTA, pH 3.5)
In generale, i metodi indotti dal calore sono più usati, probabilmente perché hanno più successo. Se stai appena iniziando il recupero dell’antigene, un buon punto di partenza sarebbe il metodo collaudato del recupero con tampone citrato. Naturalmente, se non funziona, allora hai molto da provare in seguito.
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