Contig può anche riferirsi ai cloni sovrapposti che formano una mappa fisica di un cromosoma quando viene utilizzata la strategia di sequenziamento top-down o gerarchica. In questo metodo di sequenziamento, una mappa a bassa risoluzione è fatta prima del sequenziamento al fine di fornire un quadro per guidare il successivo assemblaggio delle letture di sequenza del genoma. Questa mappa identifica le posizioni relative e la sovrapposizione dei cloni usati per il sequenziamento. Gli insiemi di cloni sovrapposti che formano un tratto contiguo di DNA sono chiamati contig; il numero minimo di cloni che formano un contig che copre l’intero cromosoma comprende il percorso di affiancamento che viene utilizzato per il sequenziamento. Una volta che un percorso di affiancamento è stato selezionato, i BAC che lo compongono vengono tagliati in frammenti più piccoli e sequenziati. I contigs forniscono quindi la struttura per il sequenziamento gerarchico. L’assemblaggio di una mappa contig comporta diversi passaggi. In primo luogo, il DNA viene tagliato in pezzi più grandi (50-200kb), che vengono clonati in BACs o PACs per formare una libreria BAC. Poiché questi cloni dovrebbero coprire l’intero genoma/cromosoma, è teoricamente possibile assemblare un contig di BAC che copre l’intero cromosoma. La realtà, tuttavia, non è sempre ideale. Spesso rimangono dei vuoti, e un’impalcatura – costituita da contigs e vuoti – che copre la regione della mappa è spesso il primo risultato. Le lacune tra i contigs possono essere chiuse con vari metodi descritti di seguito.
Costruzione di BAC contigsEdit
BAC contigs sono costruiti allineando le regioni BAC di sovrapposizione nota attraverso una varietà di metodi. Una strategia comune è quella di utilizzare la mappatura del contenuto del sito con tag di sequenza (STS) per rilevare i siti unici di DNA in comune tra i BAC. Il grado di sovrapposizione è approssimativamente stimato dal numero di marcatori STS in comune tra due cloni, con più marcatori in comune che significano una maggiore sovrapposizione. Poiché questa strategia fornisce solo una stima molto approssimativa della sovrapposizione, viene spesso utilizzata l’analisi dei frammenti di digestione della restrizione, che fornisce una misura più precisa della sovrapposizione dei cloni. In questa strategia, i cloni vengono trattati con uno o due enzimi di restrizione e i frammenti risultanti vengono separati mediante elettroforesi su gel. Se due cloni hanno due siti di restrizione in comune, è probabile che abbiano diversi frammenti in comune. Poiché il numero di frammenti in comune e la lunghezza di questi frammenti è nota (la lunghezza è giudicata dal confronto con una dimensione standard), il grado di sovrapposizione può essere dedotto con un alto grado di precisione.
Gaps tra contigsEdit
Gaps spesso rimangono dopo la costruzione iniziale BAC contig. Queste lacune si verificano se il cromosoma artificiale batterico (BAC) biblioteca schermato ha bassa complessità, nel senso che non contiene un elevato numero di STS o siti di restrizione, o se alcune regioni erano meno stabili in host di clonazione e quindi sotto rappresentati nella biblioteca. Se le lacune tra contigs rimangono dopo STS landmark mapping e restrizione fingerprinting sono stati eseguiti, il sequenziamento delle estremità contig può essere utilizzato per chiudere queste lacune. Questa strategia di sequenziamento delle estremità crea essenzialmente un nuovo STS con il quale vagliare gli altri contig. In alternativa, la sequenza finale di un contig può essere usata come un primer per attraversare il gap.