Contig může také označovat překrývající se klony, které tvoří fyzickou mapu chromozomu při použití strategie sekvenování shora dolů nebo hierarchického sekvenování. Při této metodě sekvenování se před sekvenováním vytvoří mapa s nízkým rozlišením, aby poskytla rámec pro pozdější sestavení sekvenčních čtení genomu. Tato mapa určuje relativní polohu a překrývání klonů použitých pro sekvenování. Sady překrývajících se klonů, které tvoří souvislý úsek DNA, se nazývají kontigy; minimální počet klonů, které tvoří kontig pokrývající celý chromozom, tvoří dlaždicovou cestu, která se používá pro sekvenování. Jakmile je vybrán tiling path, jsou jeho součásti BAC rozřezány na menší fragmenty a sekvenovány. Kontigy tedy představují rámec pro hierarchické sekvenování.Sestavení kontigové mapy zahrnuje několik kroků. Nejprve se DNA rozstříhá na větší části (50-200 kb), které se naklonují do BAC nebo PAC a vytvoří knihovnu BAC. Protože tyto klony by měly pokrývat celý genom/chromozom, je teoreticky možné sestavit kontig z BAC, který pokrývá celý chromozom. Skutečnost však není vždy ideální. Často zůstávají mezery a prvním výsledkem je často lešení složené z kontigů a mezer, které pokrývá oblast mapy. Mezery mezi kontigy lze uzavřít různými metodami uvedenými níže.
Konstrukce kontigů BACUpravit
Kontigy BAC se konstruují zarovnáním oblastí BAC se známým překrytím pomocí různých metod. Jednou z běžných strategií je použití mapování obsahu sekvenčně označených míst (STS) k detekci jedinečných míst DNA společných pro BAC. Stupeň překrytí se přibližně odhaduje podle počtu společných STS markerů mezi dvěma klony, přičemž více společných markerů znamená větší překrytí. Protože tato strategie poskytuje pouze velmi hrubý odhad překryvu, často se používá analýza restrikčních fragmentů, která poskytuje přesnější měření překryvu klonů. Při této strategii se klony ošetří jedním nebo dvěma restrikčními enzymy a výsledné fragmenty se rozdělí pomocí gelové elektroforézy. Pokud se jedná o dva klony, budou mít pravděpodobně společná restrikční místa, a budou tedy sdílet několik fragmentů. Protože je znám počet společných fragmentů a délka těchto fragmentů (délka se posuzuje porovnáním se standardem velikosti), lze s vysokou mírou přesnosti odvodit stupeň překrytí.
Mezery mezi kontigyUpravit
Po počáteční konstrukci kontigu BAC často zůstávají mezery. Tyto mezery vznikají v případě, že stínovaná knihovna bakteriálních umělých chromozomů (BAC) má nízkou složitost, což znamená, že neobsahuje vysoký počet STS nebo restrikčních míst, nebo pokud byly některé oblasti v klonovacích hostitelích méně stabilní, a tudíž v knihovně nedostatečně zastoupené. Pokud po provedení mapování STS orientačních bodů a restrikčního fingerprintingu zůstanou mezi kontigy mezery, lze k jejich vyplnění použít sekvenování konců kontigů. Tato strategie sekvenování konců v podstatě vytváří nový STS, s jehož pomocí se provádí screening ostatních kontigů. Alternativně lze koncovou sekvenci kontigu použít jako primer k projití mezery primerem
.