Contig kan ook verwijzen naar de overlappende klonen die een fysieke kaart van een chromosoom vormen wanneer de top-down- of hiërarchische sequencingstrategie wordt gebruikt. Bij deze sequencingmethode wordt vóór de sequencing een lage-resolutiekaart gemaakt om een kader te verschaffen voor de latere assemblage van de sequentielees van het genoom. Deze kaart identificeert de relatieve posities en overlappingen van de klonen die voor sequencing worden gebruikt. Sets van overlappende klonen die een aaneengesloten stuk DNA vormen, worden contigs genoemd; het minimum aantal klonen dat een contig vormt die het hele chromosoom bestrijkt, vormt het tiling path dat voor sequencing wordt gebruikt. Eenmaal een tegelpad geselecteerd is, worden de samenstellende BAC’s in kleinere fragmenten geschoren en gesequeneerd. Contigs vormen dus het kader voor hiërarchische sequencing. De assemblage van een contig-kaart verloopt in verschillende stappen. Eerst wordt het DNA versnipperd in grotere stukken (50-200kb), die in BAC’s of PAC’s worden gekloond om een BAC-bibliotheek te vormen. Aangezien deze klonen het volledige genoom/chromosoom moeten bestrijken, is het theoretisch mogelijk een contig van BAC’s samen te stellen die het volledige chromosoom bestrijkt. De werkelijkheid is echter niet altijd ideaal. Er blijven vaak hiaten over en een scaffold – bestaande uit contigs en hiaten – die de kaartregio bestrijkt, is vaak het eerste resultaat. De hiaten tussen contigs kunnen worden gesloten door verschillende methoden die hieronder worden beschreven.
Bouw van BAC contigsEdit
BAC contigs worden geconstrueerd door het uitlijnen van BAC regio’s van bekende overlap via een verscheidenheid van methoden. Een veelgebruikte strategie is het gebruik van sequence-tagged site (STS) content mapping om unieke gemeenschappelijke DNA-locaties tussen BAC’s op te sporen. De mate van overlapping wordt ruw geschat aan de hand van het aantal gemeenschappelijke STS-markers tussen twee klonen, waarbij meer gemeenschappelijke markers op een grotere overlap duiden. Omdat deze strategie slechts een zeer ruwe schatting van de overlap oplevert, wordt vaak gebruik gemaakt van restriction digest fragment analysis, waarmee de overlap van klonen nauwkeuriger kan worden gemeten. Bij deze strategie worden klonen met één of twee restrictie-enzymen behandeld en worden de resulterende fragmenten door gelelektroforese gescheiden. Als twee klonen, zullen ze waarschijnlijk restrictieplaatsen gemeen hebben, en zal dus delen verschillende fragmenten. Omdat het aantal fragmenten gemeen en de lengte van deze fragmenten bekend is (de lengte wordt beoordeeld door vergelijking met een grootte standaard), kan de mate van overlap worden afgeleid met een hoge mate van precisie.
Gaten tussen contigsEdit
Gaten blijven vaak na de eerste BAC contig bouw. Deze hiaten treden op als de Bacterial Artificial Chromosome (BAC) bibliotheek gescreend heeft een lage complexiteit, wat betekent dat het niet een groot aantal STS of restrictie sites bevatten, of als bepaalde regio’s waren minder stabiel in klonen hosts en dus ondervertegenwoordigd in de bibliotheek. Indien na het in kaart brengen van STS-landmarks en het bepalen van restrictiefingerprinting hiaten tussen contigs overblijven, kan de sequencing van contig-uiteinden worden gebruikt om deze hiaten te dichten. Deze eind-sequencing strategie creëert in wezen een nieuwe STS waarmee de andere contigs kunnen worden gescreend. Als alternatief kan de eindsequentie van een contig worden gebruikt als een primer om primer lopen over de kloof.