Contig também pode se referir aos clones sobrepostos que formam um mapa físico de um cromossomo quando a estratégia de seqüenciamento top-down ou hierárquico é usada. Neste método de sequenciamento, um mapa de baixa resolução é feito antes do sequenciamento, a fim de fornecer uma estrutura para orientar a montagem posterior das leituras da sequência do genoma. Este mapa identifica as posições relativas e a sobreposição dos clones utilizados para o sequenciamento. Os conjuntos de clones sobrepostos que formam um trecho contíguo de DNA são chamados de contíguos; o número mínimo de clones que formam um contigente que cobre todo o cromossomo compreende o caminho de mosaico que é usado para o sequenciamento. Uma vez selecionado um caminho de mosaico, seus componentes BACs são tosquiados em fragmentos menores e sequenciados. A montagem de um mapa de contigente envolve várias etapas. Primeiro, o DNA é tosquiado em peças maiores (50-200kb), que são clonadas em BACs ou PACs para formar uma biblioteca de BACs. Como estes clones devem cobrir todo o genoma/cromossoma, é teoricamente possível montar um contigente de BACs que cubra todo o cromossoma. A realidade, no entanto, nem sempre é a ideal. As lacunas muitas vezes permanecem, e um andaime composto de contigs e lacunas – que cobre a região do mapa é muitas vezes o primeiro resultado. As lacunas entre contigs podem ser fechadas por vários métodos descritos abaixo.
Construção de contigs BACEdit
BAC contigs são construídas alinhando regiões BAC de sobreposição conhecida através de uma variedade de métodos. Uma estratégia comum é usar o mapeamento de conteúdo de sites marcados em seqüência (STS) para detectar sites de DNA únicos em comum entre BACs. O grau de sobreposição é estimado aproximadamente pelo número de marcadores STS em comum entre dois clones, com mais marcadores em comum significando uma maior sobreposição. Como esta estratégia fornece apenas uma estimativa muito aproximada da sobreposição, a análise de fragmentos de digestão de restrição, que fornece uma medição mais precisa da sobreposição de clones, é frequentemente utilizada. Nesta estratégia, os clones são tratados com uma ou duas enzimas de restrição e os fragmentos resultantes são separados por eletroforese em gel. Se dois clones, eles provavelmente terão locais de restrição em comum, e assim compartilharão vários fragmentos. Como o número de fragmentos em comum e o comprimento desses fragmentos é conhecido (o comprimento é julgado por comparação com um padrão de tamanho), o grau de sobreposição pode ser deduzido com um alto grau de precisão.
Lacunas entre contigsEditar
Bactérias frequentemente permanecem após a construção inicial do contig BAC. Estas lacunas ocorrem se a biblioteca do Cromossoma Artificial Bacteriano (BAC) rastreada tiver baixa complexidade, significando que não contém um número elevado de STS ou locais de restrição, ou se certas regiões foram menos estáveis na clonagem de hospedeiros e, portanto, subrepresentadas na biblioteca. Se as lacunas entre contigs permanecerem após a realização do mapeamento dos pontos de referência da STS e das impressões digitais de restrição, o sequenciamento das pontas de contigente pode ser usado para fechar essas lacunas. Esta estratégia de seqüenciamento de extremidades cria essencialmente uma STS nova com a qual se pode selecionar as outras contigs. Alternativamente, a sequência final de um contig pode ser usada como um primer para o primer caminhar através da lacuna.