Contig se poate referi, de asemenea, la clonele suprapuse care formează o hartă fizică a unui cromozom atunci când se utilizează strategia de secvențiere de sus în jos sau ierarhică. În această metodă de secvențiere, se realizează o hartă de joasă rezoluție înainte de secvențiere pentru a oferi un cadru care să ghideze asamblarea ulterioară a citirilor de secvență a genomului. Această hartă identifică pozițiile relative și suprapunerea clonelor utilizate pentru secvențiere. Seturile de clone care se suprapun și care formează o porțiune contiguă de ADN se numesc contig; numărul minim de clone care formează un contig care acoperă întregul cromozom constituie traseul de tiling care este utilizat pentru secvențiere. Odată ce a fost selectat un traseu de tiling, BAC-urile care îl compun sunt tăiate în fragmente mai mici și secvențiate. Prin urmare, contig-urile oferă cadrul pentru secvențierea ierarhică.Asamblarea unei hărți contig implică mai multe etape. În primul rând, ADN-ul este tăiat în fragmente mai mari (50-200kb), care sunt clonate în BAC-uri sau PAC-uri pentru a forma o bibliotecă BAC. Deoarece aceste clone ar trebui să acopere întregul genom/cromozom, este teoretic posibil să se asambleze un contig de BAC-uri care să acopere întregul cromozom. Realitatea, însă, nu este întotdeauna ideală. Deseori rămân lacune, iar primul rezultat este adesea o schelă – formată din contig-uri și lacune – care acoperă regiunea hărții. Lacunele dintre contig-uri pot fi închise prin diverse metode prezentate mai jos.
Construcția contig-urilor BACEdit
Conting-urile BAC sunt construite prin alinierea regiunilor BAC cu suprapunere cunoscută printr-o varietate de metode. O strategie comună este utilizarea cartografierii conținutului de situsuri marcate cu secvențe (STS) pentru a detecta situsurile unice de ADN în comun între BAC-uri. Gradul de suprapunere este estimat aproximativ prin numărul de markeri STS comuni între două clone, un număr mai mare de markeri în comun semnificând o suprapunere mai mare. Deoarece această strategie oferă doar o estimare foarte aproximativă a suprapunerii, se utilizează adesea analiza fragmentelor de digestie de restricție, care oferă o măsură mai precisă a suprapunerii clonelor. În această strategie, clonele sunt tratate cu una sau două enzime de restricție, iar fragmentele rezultate sunt separate prin electroforeză pe gel. În cazul în care două clone, acestea vor avea probabil situsuri de restricție în comun și, prin urmare, vor împărți mai multe fragmente. Deoarece numărul de fragmente în comun și lungimea acestor fragmente sunt cunoscute (lungimea este apreciată prin comparație cu un standard de mărime), gradul de suprapunere poate fi dedus cu un grad ridicat de precizie.
Gaps between contigsEdit
Gaps often remain after initial BAC contig construction. Aceste lacune apar în cazul în care biblioteca de cromozomi artificiali bacterieni (Bacterial Artificial Chromosome – BAC) selectată are o complexitate scăzută, ceea ce înseamnă că nu conține un număr mare de situsuri STS sau de restricție, sau dacă anumite regiuni au fost mai puțin stabile în gazdele de clonare și, prin urmare, sunt subreprezentate în bibliotecă. În cazul în care rămân lacune între contig-uri după efectuarea cartografierii reperelor STS și a amprentei de restricție, secvențierea capetelor contig-urilor poate fi utilizată pentru a închide aceste lacune. Această strategie de secvențiere a capetelor creează, în esență, o nouă STS cu care se pot examina celelalte contig-uri. În mod alternativ, secvența finală a unui contig poate fi utilizată ca un primer pentru a traversa golul.
.