Når det drejer sig om mærkning af dine antistoffer til downstream-applikation, der kræver signaldetektion, har du to valgmuligheder. Du kan enten vælge den direkte metode eller den indirekte metode. Hvordan ved du, hvilken metode du skal bruge? Her er nogle ting, du skal vide for at sikre dig, at du vælger den rigtige metode til den påtænkte anvendelse.
Direkte antistofmærkningsmetode
Den direkte mærkning er en enkel teknik, der kan bruges til detektion af højt udtrykte antigener. Ved denne metode er hovedantistoffet konjugeret til en mærkning (f.eks. HRP, AP eller fluorokrom), så der ikke er behov for et sekundært antistof. Det betyder, at da det primære antistof gør alt arbejdet, er det ikke nødvendigt at udføre yderligere inkubations- og vasketrin. Den direkte detektionsmetode giver også stor fleksibilitet ved udformning af flerfarveeksperimenter takket være det brede udvalg af fluorochromer, der findes på markedet i dag.
Hvornår skal du bruge den direkte antistofmærkningsmetode?
Vurder at bruge denne metode, når:
- Der er stor risiko for, at det sekundære antistof ikke binder til noget specifikt.
- Det er vanskeligt at skaffe sekundære antistoffer (f.eks, når der arbejdes med primære antistoffer fra ikke-standardorganismer).
- Der er behov for at få resultater hurtigt.
Hvad er begrænsningerne ved den direkte metode?
På trods af de åbenlyse fordele, som den direkte metode har, er der tidspunkter, hvor den ikke er ideelt egnet til din anvendelse. Her er hvorfor.
- Den er ikke så følsom og alsidig sammenlignet med de indirekte metoder.
- Mærkningen af det primære antistof er muligvis ikke egnet til efterfølgende anvendelser.
- Der er et begrænset udvalg af direkte mærkede primære antistoffer, så du skal muligvis oprette et i laboratoriet, der passer til den påtænkte anvendelse.
Indirekte metoder til mærkning af antistoffer
Mens den direkte mærkningsmetode er ideel til påvisning af stærkt udtrykte antigener, er indirekte mærkningsmetoder perfekte til anvendelser, der involverer antigener, der ikke udtrykkes tydeligt. Ved at anvende mærkede sekundære antistoffer kan du opnå større følsomhed på grund af den signalforstærkning, der skyldes bindingen af flere supplerende antistoffer til det primære antistof.
Hvad er de andre fordele ved den indirekte metode?
Ud over den øgede følsomhed giver indirekte antistofmærkningsmetoder også følgende fordele:
- Det samme sekundære antistof kan anvendes på tværs af forskellige anvendelser for at validere målantigendetektion.
- Du kan anvende et hvilket som helst sekundært antistof med et hvilket som helst primært antistof af samme type og værtsart, afhængigt af den påtænkte anvendelse. Alternativt kan du nemt visualisere dit målprotein ved blot at udskifte det mærkede sekundære antistof, som du bruger.
- Der findes et bredt udvalg af tilgængelige enzym- og fluorformærkede sekundære reagenser.
Er der ulemper eller begrænsninger ved den indirekte metode?
Selv om der kan siges mange gode ting om denne metode, er den ikke egnet til alle anvendelser og kan øge den uspecifikke binding af det sekundære antistof. Den kræver også yderligere blokeringstrin og kontroller.
Almindelige metoder til mærkning og konjugering af antistoffer
- NHS (Succinimidyl) Ester-metoden – en relativt enkel metode, der anvendes til at konjugere antistoffer med fluorescerende farvestoffer. Da NHS-estere imidlertid er ekstremt ustabile og følsomme over for fugt, skal du bruge det mærkede antistof straks.
- Isothiocyanat-metode – Selv om dette reagens kan være mere stabilt sammenlignet med NHS-estere, bør reaktionerne udføres ved pH 9,5 eller højere. Desværre kan nogle monoklonale antistoffer ikke tåle høje pH-værdier.
- Carbodiimidmetode – anvender carbodiimidreagenser (f.eks. EDC) til at skabe kovalente forbindelser mellem molekyler, der indeholder amin- og carboxylgrupper. Carbodiimider er meget reaktive, så de er ideelle til antistoffer med relativt inaktive materialer.
- Two-tag-metode – denne metode kræver, at antistoffet er mærket, før der påføres en etiket.
- Periodatmetode – anvendes almindeligvis til at generere HRP-antistofkonjugater. Periodatmolekylerne i reagenset aktiverer HRP ved at reagere med kulhydratkæderne for at skabe aldehydgrupper, som derefter reagerer med lysinresterne i antistofmolekylerne.