Wenn es darum geht, Ihre Antikörper für nachgeschaltete Anwendungen zu markieren, die eine Signaldetektion erfordern, haben Sie zwei Möglichkeiten. Sie können entweder den direkten Ansatz oder den indirekten Ansatz wählen. Woher wissen Sie, welche Methode Sie verwenden sollten? Hier sind einige Dinge, die Sie wissen müssen, um sicherzustellen, dass Sie die richtige Methode für die beabsichtigte Anwendung wählen.
Direkte Antikörper-Markierungsmethode
Die direkte Markierungsmethode ist eine einfache Technik, die für den Nachweis hoch exprimierter Antigene verwendet werden kann. Bei dieser Methode wird der Hauptantikörper mit einem Marker (z. B. HRP, AP oder Fluorochrom) konjugiert, so dass kein sekundärer Antikörper erforderlich ist. Da der primäre Antikörper die gesamte Arbeit leistet, sind keine zusätzlichen Inkubations- und Waschschritte erforderlich. Die direkte Nachweismethode bietet auch eine große Flexibilität bei der Gestaltung von Multicolor-Experimenten, dank der großen Auswahl an Fluorochromen, die heute auf dem Markt erhältlich sind.
Wann sollten Sie die Methode der direkten Antikörper-Markierung verwenden?
Diese Methode ist zu erwägen, wenn:
- Es besteht ein hohes Risiko, dass der sekundäre Antikörper an nichts Spezifisches bindet.
- Es gibt Schwierigkeiten bei der Beschaffung sekundärer Antikörper (z. B.,
- Es besteht die Notwendigkeit, schnell Ergebnisse zu erhalten.
Was sind die Grenzen der direkten Methode?
Trotz der offensichtlichen Vorteile, die die direkte Methode zu bieten hat, gibt es Zeiten, in denen sie nicht ideal für Ihre Anwendung geeignet ist. Hier ist der Grund dafür.
- Im Vergleich zu den indirekten Methoden ist sie nicht so empfindlich und vielseitig.
- Die Markierung des primären Antikörpers eignet sich möglicherweise nicht für spätere Anwendungen.
- Es gibt nur eine begrenzte Auswahl an direkt markierten primären Antikörpern, so dass Sie möglicherweise im Labor einen herstellen müssen, der für die beabsichtigte Anwendung geeignet ist.
Indirekte Antikörper-Markierungsmethoden
Während die direkte Markierungsmethode ideal für den Nachweis hoch exprimierter Antigene ist, eignen sich indirekte Markierungsmethoden perfekt für Anwendungen mit Antigenen, die nicht eindeutig exprimiert werden. Durch die Verwendung von markierten sekundären Antikörpern kann eine höhere Empfindlichkeit erreicht werden, da das Signal durch die Bindung mehrerer zusätzlicher Antikörper an den primären Antikörper verstärkt wird.
Was sind die weiteren Vorteile der indirekten Methode?
Abgesehen von der erhöhten Empfindlichkeit bieten indirekte Antikörpermarkierungsmethoden auch folgende Vorteile:
- Derselbe sekundäre Antikörper kann für verschiedene Anwendungen verwendet werden, um den Nachweis von Zielantigenen zu validieren.
- Sie können jeden beliebigen sekundären Antikörper mit jedem primären Antikörper desselben Typs und derselben Wirtsspezies verwenden, je nach der beabsichtigten Anwendung. Alternativ können Sie Ihr Zielprotein leicht sichtbar machen, indem Sie einfach den von Ihnen verwendeten markierten Sekundärantikörper austauschen.
- Es gibt eine breite Palette an enzym- und fluorophor-markierten Sekundärreagenzien.
Gibt es irgendwelche Nachteile oder Einschränkungen bei der indirekten Methode?
Während viele gute Dinge über diese Methode gesagt werden können, ist sie nicht für alle Anwendungen geeignet und kann die unspezifische Bindung des Sekundärantikörpers erhöhen. Außerdem sind zusätzliche Blockierungsschritte und Kontrollen erforderlich.
Gängige Methoden zur Markierung und Konjugation von Antikörpern
- NHS (Succinimidyl)-Ester-Methode – eine relativ einfache Methode zur Konjugation von Antikörpern mit Fluoreszenzfarbstoffen. Da NHS-Ester jedoch äußerst instabil und feuchtigkeitsempfindlich sind, müssen Sie den markierten Antikörper sofort verwenden.
- Isothiocyanat-Methode – Dieses Reagenz ist zwar im Vergleich zu NHS-Estern stabiler, doch sollten die Reaktionen bei einem pH-Wert von 9,5 oder höher durchgeführt werden. Leider vertragen einige monoklonale Antikörper keine hohen pH-Werte.
- Carbodiimid-Methode – verwendet Carbodiimid-Reagenzien (z. B. EDC), um kovalente Verbindungen zwischen Molekülen mit Amin- und Carboxylgruppen herzustellen. Carbodiimide sind sehr reaktiv und eignen sich daher ideal für Antikörper mit relativ inerten Materialien.
- Zwei-Tag-Methode – bei dieser Methode muss der Antikörper vor dem Anbringen eines Markers markiert werden.
- Periodat-Methode – wird häufig zur Herstellung von HRP-Antikörper-Konjugaten verwendet. Die Periodatmoleküle im Reagenz aktivieren HRP durch Reaktion mit den Kohlenhydratketten, um Aldehydgruppen zu bilden, die dann mit den Lysinresten in den Antikörpermolekülen reagieren.