Pokud jde o značení protilátek pro následné aplikace vyžadující detekci signálu, máte dvě možnosti. Můžete zvolit buď přímý, nebo nepřímý přístup. Jak poznáte, kterou metodu použít? Zde je několik věcí, které byste měli vědět, abyste se ujistili, že jste vybrali správnou metodu pro zamýšlenou aplikaci.
Přímá metoda značení protilátek
Přímá metoda značení je jednoduchá technika, kterou lze použít pro detekci vysoce exprimovaných antigenů. Při této metodě je hlavní protilátka konjugována se značkou (např. HRP, AP nebo fluorochrom), takže není potřeba sekundární protilátka. To znamená, že vzhledem k tomu, že veškerou práci odvádí primární protilátka, nemusíte provádět žádné další inkubační a promývací kroky. Metoda přímé detekce také nabízí velkou flexibilitu při navrhování vícebarevných experimentů díky široké škále fluorochromů, které jsou dnes na trhu k dispozici.
Kdy byste měli použít metodu přímého značení protilátek?
Zvažte použití této metody, pokud:
- Existuje vysoké riziko, že se sekundární protilátka nebude vázat na nic specifického.
- Je obtížné získat sekundární protilátky (např, při práci s primárními protilátkami proti nestandardním organismům).
- Je potřeba rychle získat výsledky.
Jaká jsou omezení přímé metody?
Přes zjevné výhody, které přímá metoda nabízí, existují případy, kdy není pro vaši aplikaci ideální. Zde jsou důvody.
- V porovnání s nepřímými metodami není tak citlivá a univerzální.
- Značení primární protilátky nemusí být vhodné pro následné aplikace.
- Existuje omezená nabídka přímo značených primárních protilátek, takže možná budete muset v laboratoři vytvořit takovou, která bude vyhovovat zamýšlené aplikaci.
Metody nepřímého značení protilátek
Zatímco metoda přímého značení je ideální pro detekci vysoce exprimovaných antigenů, metody nepřímého značení jsou ideální pro aplikace zahrnující antigeny, které nejsou jasně exprimovány. Použitím značených sekundárních protilátek můžete dosáhnout vyšší citlivosti díky zesílení signálu v důsledku vazby více pomocných protilátek na primární protilátku.
Jaké jsou další výhody nepřímé metody?
Kromě zvýšené citlivosti nabízejí nepřímé metody značení protilátek také následující výhody:
- Stejnou sekundární protilátku lze použít v různých aplikacích k ověření detekce cílového antigenu.
- V závislosti na zamýšlené aplikaci můžete použít jakoukoli danou sekundární protilátku s jakoukoli primární protilátkou stejného typu a hostitelského druhu. Případně můžete cílový protein snadno vizualizovat prostou výměnou označené sekundární protilátky, kterou používáte.
- Existuje široká škála dostupných sekundárních činidel značených enzymy a fluorofory.
Má nepřímá metoda nějaké nevýhody nebo omezení?
Ačkoli lze o této metodě říci mnoho dobrého, není vhodná pro všechny aplikace a může zvýšit nespecifickou vazbu sekundární protilátky. Vyžaduje také další blokovací kroky a kontroly.
Běžné metody značení a konjugace protilátek
- Metoda NHS (sukcinimidyl) esterů – poměrně jednoduchá metoda používaná ke konjugaci protilátek s fluorescenčními barvivy. Protože jsou však estery NHS extrémně nestabilní a citlivé na vlhkost, budete muset značenou protilátku použít okamžitě.
- Isothiokyanátová metoda – toto činidlo může být ve srovnání s estery NHS stabilnější, reakce by se však měly provádět při pH 9,5 nebo vyšším. Některé monoklonální protilátky bohužel nesnesou vysoké hodnoty pH.
- Karbodiimidová metoda – používá karbodiimidová činidla (např. EDC) k vytvoření kovalentních vazeb mezi molekulami obsahujícími aminové a karboxylové skupiny. Karbodiimidy jsou vysoce reaktivní, takže jsou ideální pro protilátky s relativně inertními materiály.
- Metoda dvou značek – tato metoda vyžaduje, aby byla protilátka před připojením značky označena.
- Periodátová metoda – běžně se používá k vytváření konjugátů HRP s protilátkou. Molekuly periodátu v činidle aktivují HRP reakcí se sacharidovými řetězci za vzniku aldehydových skupin, které pak reagují s lysinovými zbytky v molekulách protilátek.
.