Când vine vorba de marcarea anticorpilor pentru aplicațiile din aval care necesită detectarea semnalului, aveți două opțiuni. Puteți opta fie pentru abordarea directă, fie pentru cea indirectă. Cum știți ce metodă să folosiți? Iată câteva lucruri pe care trebuie să le știți pentru a vă asigura că alegeți metoda potrivită pentru aplicația dorită.
Metoda de marcare directă a anticorpilor
Metoda de marcare directă este o tehnică simplă care poate fi utilizată pentru detectarea antigenelor foarte exprimate. În această metodă, anticorpul principal este conjugat cu un marker (de exemplu, HRP, AP sau fluorocrom), astfel încât nu este nevoie de un anticorp secundar. Aceasta înseamnă că, din moment ce anticorpul primar face toată treaba, nu trebuie să efectuați etape suplimentare de incubare și spălare. Metoda de detecție directă oferă, de asemenea, o mare flexibilitate în proiectarea experimentelor multicolore, datorită gamei largi de fluorocromi disponibile pe piață în prezent.
Când ar trebui să folosiți metoda de marcare directă a anticorpilor?
Considerați utilizarea acestei metode atunci când:
- Există un risc ridicat ca anticorpul secundar să nu se lege la nimic specific.
- Există dificultăți în obținerea anticorpilor secundari (de ex, atunci când se lucrează cu anticorpi primari de organisme non-standard).
- Există necesitatea de a obține rezultate rapid.
Care sunt limitările metodei directe?
În ciuda avantajelor aparente pe care le oferă metoda directă, există momente în care aceasta nu este ideală pentru aplicația dumneavoastră. Iată de ce.
- Nu este la fel de sensibilă și versatilă în comparație cu metodele indirecte.
- Este posibil ca marcajul anticorpului primar să nu fie adecvat pentru aplicațiile ulterioare.
- Există o gamă limitată de anticorpi primari marcați direct, astfel încât este posibil să trebuiască să creați în laborator unul care să se potrivească aplicației dorite.
Metode de marcare indirectă a anticorpilor
În timp ce metoda de marcare directă este ideală pentru detectarea antigenelor puternic exprimate, metodele de marcare indirectă sunt perfecte pentru aplicații care implică antigene care nu sunt exprimate în mod clar. Prin utilizarea anticorpilor secundari marcați, puteți obține o sensibilitate mai mare datorită amplificării semnalului care rezultă din legarea mai multor anticorpi auxiliari la anticorpul primar.
Care sunt celelalte avantaje ale metodei indirecte?
Pe lângă sensibilitatea crescută, metodele indirecte de marcare a anticorpilor oferă, de asemenea, următoarele avantaje:
- Același anticorp secundar poate fi utilizat în diferite aplicații pentru a valida detectarea antigenului țintă.
- Puteți utiliza orice anticorp secundar dat cu orice anticorp primar de același tip și specie gazdă, în funcție de aplicația preconizată. Alternativ, puteți vizualiza cu ușurință proteina țintă prin simpla schimbare a anticorpului secundar marcat pe care îl utilizați.
- Există o gamă largă de reactivi secundari disponibili marcați cu enzime și cu fluorofori.
Există dezavantaje sau limitări ale metodei indirecte?
În timp ce se pot spune multe lucruri bune despre această metodă, ea nu este potrivită pentru toate aplicațiile și poate crește legarea nespecifică a anticorpului secundar. De asemenea, necesită etape de blocare și controale suplimentare.
Metode comune de marcare și conjugare a anticorpilor
- Metoda esterului NHS (succinimidil) – o metodă relativ simplă utilizată pentru conjugarea anticorpilor cu coloranți fluorescenți. Cu toate acestea, deoarece esterii NHS sunt extrem de instabili și sensibili la umiditate, va trebui să utilizați imediat anticorpul marcat.
- Metoda izotiocianatului – Deși acest reactiv poate fi mai stabil în comparație cu esterii NHS, reacțiile trebuie efectuate la pH 9,5 sau mai mare. Din nefericire, unii anticorpi monoclonali nu pot suporta valori ridicate ale pH-ului.
- Metoda carbodiimidei – utilizează reactivi de carbodiimidă (de exemplu, EDC) pentru a crea legături covalente între moleculele care conțin grupe amină și carboxil. Carbodiimidele sunt foarte reactive, astfel încât sunt ideale pentru anticorpi cu materiale relativ inerte.
- Metoda celor două etichete – această metodă necesită ca anticorpul să fie marcat înainte de atașarea unei etichete.
- Metoda periodatului – utilizată în mod obișnuit pentru a genera conjugate HRP-anticorp. Moleculele de periodat din reactiv activează HRP prin reacția cu lanțurile de carbohidrați pentru a crea grupări aldehidă care apoi reacționează cu reziduurile de lizină din moleculele de anticorpi.
.