Quando se trata de rotular os seus anticorpos para aplicação a jusante que requer detecção de sinal, você tem duas escolhas. Você pode optar pela abordagem direta ou pela abordagem indireta. Como você sabe qual método usar? Aqui estão algumas coisas que você precisa saber para ter certeza de escolher o método certo para a aplicação pretendida.
O método de etiquetagem direta de anticorpos
O método de etiquetagem direta é uma técnica simples que pode ser usada para a detecção de antígenos altamente expressos. Neste método, o anticorpo principal é conjugado a uma etiqueta (por exemplo, HRP, AP, ou fluorocromo), de modo que não há necessidade de um anticorpo secundário. Isto significa que como o anticorpo primário está fazendo todo o trabalho, você não precisa realizar nenhuma etapa adicional de incubação e lavagem. O método de detecção direta também oferece grande flexibilidade na concepção de experimentos multicoloridos, graças à ampla gama de fluorocromos disponíveis no mercado atualmente.
Quando você deve usar o método de etiquetagem direta de anticorpos?
Considerando usar este método quando:
- Há um risco elevado de que o anticorpo secundário não se ligue a nada específico.
- Há dificuldade em obter anticorpos secundários (por exemplo quando se trabalha com anticorpos primários de organismos não-standard).
- É necessário obter resultados rapidamente.
Quais são as limitações do método directo?
Apesar das vantagens aparentes que o método directo tem para oferecer, há momentos em que não é ideal para a sua aplicação. Eis porque.
- Não é tão sensível e versátil comparado com os métodos indirectos.
- O rótulo do anticorpo primário pode não ser adequado para aplicações subsequentes.
- Existe uma gama limitada de anticorpos primários directamente rotulados, pelo que poderá ser necessário criar um no laboratório que se adeqúe à aplicação pretendida.
Indirect Antibody Labeling Methods
Embora o método de etiquetagem directa seja ideal para detectar antigénios altamente expressos, os métodos de etiquetagem indirecta são perfeitos para aplicações que envolvem antigénios que não são expressos claramente. Usando anticorpos secundários rotulados, você pode alcançar maior sensibilidade devido à amplificação do sinal resultante da ligação de múltiplos anticorpos auxiliares ao anticorpo primário.
Quais são as outras vantagens do método indireto?
Além do aumento da sensibilidade, os métodos de rotulagem de anticorpos indiretos também oferecem as seguintes vantagens:
- O mesmo anticorpo secundário pode ser usado em diferentes aplicações para validar a detecção do antígeno alvo.
- Você pode usar qualquer anticorpo secundário com qualquer anticorpo primário do mesmo tipo e espécie hospedeira, dependendo da aplicação pretendida. Alternativamente, você pode visualizar facilmente sua proteína alvo simplesmente trocando o anticorpo secundário rotulado que você está usando.
- Existe uma grande variedade de reagentes secundários rotulados com enzimas e fluoróforos.
Existem desvantagens ou limitações ao método indireto?
Embora muitas coisas boas possam ser ditas sobre este método, ele não é adequado para todas as aplicações e pode aumentar a ligação não específica do anticorpo secundário. Também requer passos e controles adicionais de bloqueio.
Métodos de Marcação e Conjugação de Anticorpos Comuns
- Método Ester (Succinimidil) – um método relativamente simples usado para conjugar anticorpos com corantes fluorescentes. Entretanto, como os ésteres do NHS são extremamente instáveis e sensíveis à umidade, você precisará usar o anticorpo rotulado imediatamente.
- Método do Isotiocianato – Embora este reagente possa ser mais estável comparado aos ésteres do NHS, as reações devem ser realizadas com pH 9,5 ou superior. Infelizmente, alguns anticorpos monoclonais não suportam valores elevados de pH.
- Método Carbodiimida – utiliza reagentes carbodiimidas (por exemplo, EDC) para criar ligações covalentes entre moléculas contendo grupos amina e carboxil. Os carbodiimidas são altamente reactivos, por isso são ideais para anticorpos com materiais relativamente inertes.
- Two-tag Method – este método requer que o anticorpo seja marcado antes da fixação de uma etiqueta.
- Periodate Method – comumente usado para gerar conjugados de anticorpos HRP. As moléculas de periodato no reagente ativam o HRP reagindo com as cadeias de carboidratos para criar grupos de aldeídos que então reagem com os resíduos de lisina nas moléculas de anticorpos.