När det gäller att märka dina antikroppar för nedströmstillämpning som kräver signaldetektion har du två valmöjligheter. Du kan antingen välja den direkta metoden eller den indirekta metoden. Hur vet du vilken metod du ska använda? Här är några saker du behöver veta för att se till att du väljer rätt metod för den avsedda tillämpningen.
Direkt antikroppsmärkningsmetod
Den direkta märkningsmetoden är en enkel teknik som kan användas för att detektera högt uttryckta antigener. I denna metod är huvudantikroppen konjugerad till en märkning (t.ex. HRP, AP eller fluorokrom) så att det inte behövs någon sekundär antikropp. Detta innebär att eftersom den primära antikroppen gör allt arbete behöver du inte utföra några ytterligare inkubations- och tvättsteg. Den direkta detektionsmetoden ger också stor flexibilitet vid utformning av flerfärgsexperiment, tack vare det breda utbudet av fluorokromer som finns på marknaden idag.
När ska du använda den direkta antikroppsmärkningsmetoden?
Konsultera att använda denna metod när:
- Det finns en stor risk för att den sekundära antikroppen inte kommer att binda till något specifikt.
- Det är svårt att få tag på sekundära antikroppar (t.ex, när man arbetar med primära antikroppar som inte är standardiserade för organismer).
- Det finns ett behov av att få resultat snabbt.
Vilka begränsningar finns det för den direkta metoden?
Trots de uppenbara fördelarna som den direkta metoden har att erbjuda finns det tillfällen då den inte är idealiskt lämpad för din tillämpning. Här är varför.
- Den är inte lika känslig och mångsidig jämfört med de indirekta metoderna.
- Den primära antikroppens märkning kanske inte är lämplig för efterföljande tillämpningar.
- Det finns ett begränsat utbud av direktmärkta primära antikroppar, så det kan hända att du måste skapa en sådan i laboratoriet som passar den avsedda tillämpningen.
Indirekta antikroppsmärkningsmetoder
Men medan den direkta märkningsmetoden är idealisk för att detektera högt uttryckta antigener är indirekta märkningsmetoder perfekta för tillämpningar med antigener som inte uttrycks tydligt. Genom att använda märkta sekundära antikroppar kan man uppnå större känslighet på grund av den signalförstärkning som följer av att flera sekundära antikroppar binds till den primära antikroppen.
Vilka andra fördelar finns det med den indirekta metoden?
Bortsett från den ökade känsligheten erbjuder indirekta antikroppsmärkningsmetoder också följande fördelar:
- Den samma sekundära antikroppen kan användas i olika tillämpningar för att validera målantigenupptäckt.
- Du kan använda en given sekundär antikropp med en primär antikropp av samma typ och värddjursspecies, beroende på den avsedda tillämpningen. Alternativt kan du enkelt visualisera ditt målprotein genom att helt enkelt byta ut den märkta sekundära antikropp du använder.
- Det finns ett brett utbud av tillgängliga enzym- och fluoroformärkta sekundära reagens.
Är det några nackdelar eller begränsningar med den indirekta metoden?
Men även om mycket gott kan sägas om den här metoden är den inte lämplig för alla tillämpningar och kan öka den sekundära antikroppens ospecifika bindning. Den kräver också ytterligare blockeringssteg och kontroller.
Vanliga metoder för märkning och konjugering av antikroppar
- NHS (Succinimidyl) Estermetoden – en relativt enkel metod som används för att konjugera antikroppar med fluorescerande färgämnen. Eftersom NHS-estrar är extremt instabila och känsliga för fukt måste du dock använda den märkta antikroppen omedelbart.
- Isothiocyanatmetod – Även om detta reagens kan vara mer stabilt jämfört med NHS-estrar bör reaktionerna utföras vid pH 9,5 eller högre. Tyvärr tål vissa monoklonala antikroppar inte höga pH-värden.
- Karbodiimidmetoden – använder karbodiimidreagenser (t.ex. EDC) för att skapa kovalenta länkar mellan molekyler som innehåller amin- och karboxylgrupper. Karbodiimider är mycket reaktiva, så de är idealiska för antikroppar med relativt inerta material.
- Två-tag-metoden – denna metod kräver att antikroppen är märkt innan en etikett fästs.
- Periodat-metoden – används vanligen för att generera HRP-antikroppskonjugat. Periodatmolekylerna i reagensen aktiverar HRP genom att reagera med kolhydratkedjorna för att skapa aldehydgrupper som sedan reagerar med lysinresterna i antikroppsmolekylerna.