Ha jeldetektálást igénylő downstream alkalmazáshoz szükséges antitestek jelölésére kerül sor, két lehetőség közül választhat. Választhatja a közvetlen vagy az indirekt megközelítést. Honnan tudja, hogy melyik módszert alkalmazza? Íme néhány dolog, amit tudnia kell, hogy biztosan a megfelelő módszert válassza a tervezett alkalmazáshoz.
Direkt antitestjelölési módszer
A közvetlen jelölési módszer egy egyszerű technika, amely nagymértékben expresszált antigének kimutatására használható. Ebben a módszerben a fő antitestet egy jelölőanyaggal (pl. HRP, AP vagy fluorokróm) konjugálják, így nincs szükség másodlagos antitestre. Ez azt jelenti, hogy mivel az elsődleges antitest végzi az összes munkát, nincs szükség további inkubációs és mosási lépésekre. A közvetlen detektálási módszer nagy rugalmasságot kínál a többszínű kísérletek tervezésében is, köszönhetően a piacon ma kapható fluorokrómok széles választékának.
Mikor érdemes a közvetlen antitestjelölési módszert alkalmazni?
Ezt a módszert akkor érdemes használni, ha:
- Nagy a kockázata annak, hogy a másodlagos antitest nem kötődik semmi specifikushoz.
- Nehézséget okoz a másodlagos antitestek beszerzése (pl., ha nem szabványos szervezetek elsődleges antitestjeivel dolgozunk).
- Gyors eredményekre van szükség.
Melyek a közvetlen módszer korlátai?
A közvetlen módszer nyilvánvaló előnyei ellenére vannak olyan esetek, amikor nem ideális az alkalmazáshoz. Íme, miért.
- Az indirekt módszerekhez képest nem olyan érzékeny és sokoldalú.
- A primer antitest jelölése nem biztos, hogy alkalmas a későbbi alkalmazásokhoz.
- A közvetlenül jelölt primer antitestek választéka korlátozott, ezért előfordulhat, hogy a laboratóriumban kell létrehoznia a tervezett alkalmazásnak megfelelőt.
Közvetett antitest-jelölési módszerek
Míg a közvetlen jelölési módszer ideális az erősen expresszált antigének kimutatására, az indirekt jelölési módszerek tökéletesek a nem egyértelműen expresszált antigénekkel kapcsolatos alkalmazásokhoz. Jelölt másodlagos antitestek használatával nagyobb érzékenységet érhetünk el a több segédantitestnek az elsődleges antitesthez való kötődéséből eredő jelerősítésnek köszönhetően.
Melyek az indirekt módszer további előnyei?
A megnövekedett érzékenység mellett az indirekt antitestjelölési módszerek a következő előnyökkel is rendelkeznek:
- A célantigén kimutatásának validálására ugyanaz a másodlagos antitest használható különböző alkalmazásokban.
- A tervezett alkalmazástól függően bármely adott másodlagos antitestet bármely azonos típusú és gazdafajhoz tartozó elsődleges antitesttel használhat. Alternatív megoldásként egyszerűen vizualizálhatja a célfehérjét, ha egyszerűen kicseréli a használt jelölt másodlagos antitestet.
- A rendelkezésre álló enzim- és fluorofórral jelölt másodlagos reagensek széles választéka áll rendelkezésre.
Vannak-e hátrányai vagy korlátai az indirekt módszernek?
Míg sok jót lehet elmondani erről a módszerről, nem minden alkalmazáshoz alkalmas, és növelheti a másodlagos antitest nem specifikus kötődését. Emellett további blokkolási lépéseket és kontrollokat igényel.
Gyakori antitestjelölési és konjugációs módszerek
- NHS (szukcinimidil) észter módszer – viszonylag egyszerű módszer, amelyet az antitestek fluoreszcens festékekkel való konjugálására használnak. Mivel azonban az NHS-észterek rendkívül instabilak és érzékenyek a nedvességre, a megjelölt antitestet azonnal fel kell használni.
- Izotiocianát módszer – Bár ez a reagens az NHS-észterekhez képest stabilabb lehet, a reakciókat 9,5 vagy magasabb pH-n kell elvégezni. Sajnos egyes monoklonális antitestek nem bírják a magas pH-értékeket.
- Karbodiimid módszer – karbodiimid reagenseket (pl. EDC) használ az amin- és karboxilcsoportokat tartalmazó molekulák közötti kovalens kapcsolatok létrehozására. A karbodiimidek erősen reaktívak, ezért ideálisak viszonylag inert anyagokkal rendelkező antitestekhez.
- Kétcímkés módszer – ennél a módszernél az antitestet a jelölőanyag rögzítése előtt meg kell jelölni.
- Periodát módszer – általában HRP-antitest konjugátumok előállítására használják. A reagensben lévő periodát molekulák aktiválják a HRP-t azáltal, hogy a szénhidrátláncokkal reagálva aldehidcsoportokat hoznak létre, amelyek aztán az antitestmolekulák lizinmaradványaival reagálnak.