Jeśli chodzi o znakowanie przeciwciał do dalszych zastosowań wymagających wykrywania sygnału, masz dwa wyjścia. Można wybrać metodę bezpośrednią lub pośrednią. Skąd wiadomo, której metody należy użyć? Oto kilka rzeczy, które należy wiedzieć, aby upewnić się, że wybrano właściwą metodę dla zamierzonego zastosowania.
Metoda bezpośredniego znakowania przeciwciał
Metoda bezpośredniego znakowania jest prostą techniką, która może być stosowana do wykrywania antygenów o wysokiej ekspresji. W tej metodzie, główne przeciwciało jest sprzężone z etykietą (np. HRP, AP lub fluorochromem), więc nie ma potrzeby stosowania przeciwciała wtórnego. Oznacza to, że ponieważ przeciwciało główne wykonuje całą pracę, nie trzeba wykonywać żadnych dodatkowych etapów inkubacji i płukania. Metoda bezpośredniej detekcji oferuje również dużą elastyczność w projektowaniu wielokolorowych eksperymentów, dzięki szerokiej gamie fluorochromów dostępnych obecnie na rynku.
Kiedy należy stosować metodę bezpośredniego znakowania przeciwciał?
Rozważ użycie tej metody, gdy:
- Istnieje duże ryzyko, że przeciwciało drugorzędowe nie zwiąże się z niczym specyficznym.
- Istnieją trudności z uzyskaniem przeciwciał drugorzędowych (np, podczas pracy z niestandardowymi przeciwciałami pierwotnymi organizmu).
- Istnieje potrzeba szybkiego uzyskania wyników.
Jakie są ograniczenia metody bezpośredniej?
Pomimo oczywistych zalet, jakie ma do zaoferowania metoda bezpośrednia, istnieją sytuacje, w których nie nadaje się ona idealnie do danego zastosowania. Oto dlaczego.
- Nie jest ona tak czuła i wszechstronna w porównaniu z metodami pośrednimi.
- Znakowanie przeciwciała pierwotnego może nie być odpowiednie dla kolejnych zastosowań.
- Istnieje ograniczona gama bezpośrednio znakowanych przeciwciał pierwotnych, więc może być konieczne utworzenie w laboratorium takiego, które odpowiada zamierzonemu zastosowaniu.
Metody pośredniego znakowania przeciwciał
Podczas gdy metoda bezpośredniego znakowania jest idealna do wykrywania antygenów o wysokiej ekspresji, metody pośredniego znakowania są idealne do zastosowań obejmujących antygeny, które nie ulegają wyraźnej ekspresji. Używając znakowanych przeciwciał drugorzędowych, można osiągnąć większą czułość dzięki wzmocnieniu sygnału wynikającemu z wiązania wielu przeciwciał pomocniczych z przeciwciałem pierwszorzędowym.
Jakie są inne zalety metody pośredniej?
Oprócz zwiększonej czułości, pośrednie metody znakowania przeciwciał oferują również następujące zalety:
- To samo przeciwciało drugorzędowe może być używane w różnych zastosowaniach do walidacji wykrywania antygenu docelowego.
- Można używać dowolnego danego przeciwciała drugorzędowego z dowolnym przeciwciałem pierwszorzędowym tego samego typu i gatunku gospodarza, w zależności od zamierzonego zastosowania. Alternatywnie, można łatwo wizualizować białko docelowe, po prostu zamieniając używane znakowane przeciwciało drugorzędowe.
- Istnieje szeroka gama dostępnych odczynników drugorzędowych znakowanych enzymami i fluoroforami.
Czy istnieją jakieś wady lub ograniczenia metody pośredniej?
Choć wiele dobrego można powiedzieć o tej metodzie, nie jest ona odpowiednia do wszystkich zastosowań i może zwiększać niespecyficzne wiązanie przeciwciała drugorzędowego. Wymaga ona również dodatkowych etapów blokowania i kontroli.
Powszechne metody znakowania i koniugacji przeciwciał
- Metoda estrów NHS (sukcynimidylowych) – stosunkowo prosta metoda stosowana do koniugacji przeciwciał z barwnikami fluorescencyjnymi. Jednakże, ponieważ estry NHS są bardzo niestabilne i wrażliwe na wilgoć, należy natychmiast użyć znakowanego przeciwciała.
- Metoda izotiocyjanianu – chociaż ten odczynnik może być bardziej stabilny w porównaniu z estrami NHS, reakcje powinny być przeprowadzane w pH 9,5 lub wyższym. Niestety, niektóre przeciwciała monoklonalne nie wytrzymują wysokich wartości pH.
- Metoda karbodiimidowa – wykorzystuje odczynniki karbodiimidowe (np. EDC) do tworzenia połączeń kowalencyjnych pomiędzy cząsteczkami zawierającymi grupy aminowe i karboksylowe. Karbodiimidy są wysoce reaktywne, więc są idealne do przeciwciał ze stosunkowo obojętnymi materiałami.
- Metoda dwóch znaczników – ta metoda wymaga oznaczenia przeciwciała przed dołączeniem etykiety.
- Metoda okresowa – powszechnie stosowana do generowania koniugatów HRP-przeciwciało. Cząsteczki nadjodanu w odczynniku aktywują HRP poprzez reakcję z łańcuchami węglowodanów w celu utworzenia grup aldehydowych, które następnie reagują z resztami lizyny w cząsteczkach przeciwciał.
.