Kun haluat leimata vasta-aineesi signaalin havaitsemista vaativaa jatkojalostussovellusta varten, sinulla on kaksi vaihtoehtoa. Voit valita joko suoran tai epäsuoran lähestymistavan. Mistä tiedät, kumpaa menetelmää kannattaa käyttää? Seuraavassa on muutamia asioita, jotka sinun on tiedettävä, jotta voit varmistaa, että valitset oikean menetelmän aiottua sovellusta varten.
Suora vasta-aineen leimausmenetelmä
Suora leimausmenetelmä on yksinkertainen tekniikka, jota voidaan käyttää voimakkaasti ilmentyneiden antigeenien havaitsemiseen. Tässä menetelmässä päävasta-aine on konjugoitu merkkiaineeseen (esim. HRP, AP tai fluorokromi), joten toissijaista vasta-ainetta ei tarvita. Tämä tarkoittaa, että koska päävasta-aine tekee kaiken työn, sinun ei tarvitse suorittaa ylimääräisiä inkubointi- ja pesuvaiheita. Suora osoitusmenetelmä tarjoaa myös suurta joustavuutta monivärikokeiden suunnittelussa, koska markkinoilla on nykyään saatavilla laaja valikoima fluorokromeja.
Milloin kannattaa käyttää suoraa vasta-aineen leimausmenetelmää?
Harkitse tämän menetelmän käyttöä silloin, kun:
- On suuri riski, että sekundäärivasta-aine ei sitoudu mihinkään spesifiseen.
- On vaikea saada sekundäärivasta-aineita (esim, kun työskennellään muiden kuin vakio-organismien primaarivasta-aineiden kanssa).
- Tulokset on saatava nopeasti.
Mitkä ovat suoran menetelmän rajoitukset?
Suoran menetelmän ilmeisistä eduista huolimatta on tilanteita, joissa se ei sovellu ihanteellisesti sovellukseen. Seuraavassa kerrotaan, miksi.
- Se ei ole yhtä herkkä ja monipuolinen kuin epäsuorat menetelmät.
- Primäärivasta-aineen leima ei välttämättä sovellu myöhempiin sovelluksiin.
- Suorasti leimattujen primäärivasta-aineiden valikoima on rajallinen, joten saatat joutua valmistamaan laboratoriossa sellaisen vasta-aineen, joka soveltuu aiottuun sovellukseen.
Epäsuorat vasta-ainemerkintämenetelmät
Ja vaikka suora merkintämenetelmä sopii erinomaisesti voimakkaasti ilmentyneiden antigeenien havaitsemiseen, epäsuorat merkintämenetelmät sopivat erinomaisesti sovelluksiin, joissa on mukana antigeenejä, jotka eivät ilmenty selvästi. Käyttämällä leimattuja sekundäärivasta-aineita voidaan saavuttaa suurempi herkkyys, joka johtuu signaalin vahvistumisesta, joka johtuu useiden sekundäärivasta-aineiden sitoutumisesta primaarivasta-aineeseen.
Mitkä ovat epäsuoran menetelmän muut edut?
Suurentuneen herkkyyden lisäksi epäsuorat vasta-ainemerkintämenetelmät tarjoavat myös seuraavia etuja:
- Samaa toissijaista vasta-ainetta voidaan käyttää eri sovelluksissa kohdeantigeenin havaitsemisen validoimiseksi.
- Voit käyttää mitä tahansa toissijaista vasta-ainetta minkä tahansa samantyyppisen ja saman isäntälajin primaarisen vasta-aineen kanssa aiotusta sovelluksesta riippuen. Vaihtoehtoisesti voit helposti visualisoida kohdeproteiinisi yksinkertaisesti vaihtamalla käyttämäsi leimatun sekundäärivasta-aineen.
- Valikoimassa on laaja valikoima entsyymi- ja fluoroforileimattuja sekundäärisiä reagensseja.
Onko epäsuorassa menetelmässä mitään haittoja tai rajoituksia?
Vaikka tästä menetelmästä voidaan sanoa paljon hyvää, se ei sovellu kaikkiin sovelluksiin, ja sekundäärisen vasta-aineen epäspesifinen sitoutuminen voi kasvaa. Se vaatii myös ylimääräisiä estovaiheita ja kontrolleja.
Yleiset vasta-aineiden merkintä- ja konjugaatiomenetelmät
- NHS-(sukkinimidyyli)esterimenetelmä – suhteellisen yksinkertainen menetelmä, jota käytetään vasta-aineiden konjugointiin fluoresoivien väriaineiden kanssa. Koska NHS-esterit ovat kuitenkin erittäin epävakaita ja herkkiä kosteudelle, leimattu vasta-aine on käytettävä välittömästi.
- Isotiosyanaattimenetelmä – Vaikka tämä reagenssi saattaa olla vakaampi kuin NHS-esterit, reaktiot on suoritettava pH:ssa 9,5 tai korkeammassa. Valitettavasti jotkin monoklonaaliset vasta-aineet eivät kestä korkeita pH-arvoja.
- Karbodiimidimenetelmä – käyttää karbodiimidireagensseja (esim. EDC) luodakseen kovalenttisia yhteyksiä amiini- ja karboksyyliryhmiä sisältävien molekyylien välille. Karbodiimidit ovat erittäin reaktiivisia, joten ne ovat ihanteellisia vasta-aineille, joilla on suhteellisen inerttejä materiaaleja.
- Kahden tunnisteen menetelmä – tämä menetelmä edellyttää, että vasta-aine merkitään ennen leiman kiinnittämistä.
- Periodaattimenetelmä – käytetään yleisesti HRP-vasta-ainekonjugaattien tuottamiseen. Reagenssin periodaattimolekyylit aktivoivat HRP:tä reagoimalla hiilihydraattiketjujen kanssa muodostaen aldehydiryhmiä, jotka sitten reagoivat vasta-ainemolekyylien lysiinijäämien kanssa.