Wanneer u uw antilichamen wilt labelen voor downstream-toepassingen waarvoor signaaldetectie vereist is, hebt u twee keuzes. U kunt kiezen voor de directe benadering of voor de indirecte benadering. Hoe weet u welke methode u moet gebruiken? Hier zijn enkele dingen die u moet weten om ervoor te zorgen dat u de juiste methode kiest voor de beoogde toepassing.
Directe antilichaam-labeling methode
De directe labeling methode is een eenvoudige techniek die kan worden gebruikt voor het detecteren van sterk tot expressie komende antigenen. Bij deze methode wordt het belangrijkste antilichaam geconjugeerd met een label (bv. HRP, AP of fluorochroom), zodat er geen secundair antilichaam nodig is. Dit betekent dat, aangezien het primaire antilichaam al het werk doet, u geen extra incubatie- en wasstappen hoeft uit te voeren. De directe detectiemethode biedt ook een grote flexibiliteit bij het ontwerpen van meerkleurige experimenten, dankzij het brede scala aan fluorochromen dat tegenwoordig op de markt is.
Wanneer moet u de directe antilichaam-labelingmethode gebruiken?
Overweeg het gebruik van deze methode wanneer:
- Er een groot risico is dat het secundaire antilichaam niet aan iets specifieks bindt.
- Er moeilijkheden zijn bij het verkrijgen van secundaire antilichamen (bijv,
- Er moeten snel resultaten worden verkregen.
Wat zijn de beperkingen van de directe methode?
Ondanks de duidelijke voordelen die de directe methode te bieden heeft, zijn er momenten dat deze niet ideaal geschikt is voor uw toepassing. Hier is waarom.
- Het is niet zo gevoelig en veelzijdig in vergelijking met de indirecte methoden.
- Het label van het primaire antilichaam kan niet geschikt zijn voor latere toepassingen.
- Er is een beperkt aanbod van direct gelabelde primaire antilichamen, zodat u wellicht een in het lab moet maken die past bij de beoogde toepassing.
Indirecte antilichaam-labeling methoden
Terwijl de directe labeling methode ideaal is voor het opsporen van sterk tot expressie gebrachte antigenen, zijn indirecte labeling methoden perfect voor toepassingen met antigenen die niet duidelijk tot expressie worden gebracht. Door gebruik te maken van gelabelde secundaire antilichamen kunt u een grotere gevoeligheid bereiken als gevolg van de signaalversterking die het gevolg is van de binding van meerdere nevenantilichamen aan het primaire antilichaam.
Wat zijn de andere voordelen van de indirecte methode?
Naast de verhoogde gevoeligheid bieden indirecte antilichaam-labelingmethoden ook de volgende voordelen:
- Hetzelfde secundaire antilichaam kan in verschillende toepassingen worden gebruikt om de detectie van doelantigenen te valideren.
- U kunt elk gegeven secundair antilichaam gebruiken met elk primair antilichaam van hetzelfde type en dezelfde gastheersoort, afhankelijk van de beoogde toepassing. Als alternatief kunt u uw doeleiwit gemakkelijk visualiseren door eenvoudig het gelabelde secundaire antilichaam dat u gebruikt te verwisselen.
- Er is een breed scala van beschikbare enzym- en fluorofoorgelabelde secundaire reagentia.
Zijn er nadelen of beperkingen aan de indirecte methode?
Hoewel er veel goeds over deze methode kan worden gezegd, is zij niet geschikt voor alle toepassingen en kan zij de niet-specifieke binding van het secundaire antilichaam verhogen. Het vereist ook extra blokkerende stappen en controles.
Gemeenschappelijke Antilichaam Labeling en Conjugatie Methoden
- NHS (Succinimidyl) Ester Methode – een relatief eenvoudige methode gebruikt om antilichamen te conjugeren met fluorescerende kleurstoffen. Aangezien NHS-esters echter uiterst onstabiel en gevoelig voor vocht zijn, moet u het gelabelde antilichaam onmiddellijk gebruiken.
- Isothiocyanaatmethode – hoewel dit reagens stabieler is in vergelijking met NHS-esters, moeten de reacties worden uitgevoerd bij pH 9,5 of hoger. Helaas zijn sommige monoklonale antilichamen niet bestand tegen hoge pH-waarden.
- Carbodiimidemethode – maakt gebruik van carbodiimidereagentia (bv. EDC) om covalente verbindingen tot stand te brengen tussen moleculen die amine- en carboxylgroepen bevatten. Carbodiimiden zijn zeer reactief, zodat ze ideaal zijn voor antilichamen met relatief inerte materialen.
- Twee-tag Methode – deze methode vereist dat het antilichaam wordt getagd voorafgaand aan de bevestiging van een label.
- Periodaat Methode – algemeen gebruikt voor het genereren van HRP-antilichaam conjugaten. De periodaatmoleculen in het reagens activeren HRP door te reageren met de koolhydraatketens om aldehydegroepen te creëren die vervolgens reageren met de lysineresten in de antilichaammoleculen.