Cuando se trata de etiquetar sus anticuerpos para una aplicación posterior que requiere la detección de señales, tiene dos opciones. Puede optar por el método directo o por el indirecto. ¿Cómo saber qué método utilizar? A continuación se indican algunos aspectos que debe conocer para asegurarse de elegir el método adecuado para la aplicación prevista.
Método de etiquetado directo de anticuerpos
El método de etiquetado directo es una técnica sencilla que puede utilizarse para detectar antígenos altamente expresados. En este método, el anticuerpo principal se conjuga con una etiqueta (por ejemplo, HRP, AP o fluorocromo), por lo que no es necesario un anticuerpo secundario. Esto significa que, dado que el anticuerpo principal está haciendo todo el trabajo, no es necesario realizar ningún paso adicional de incubación y lavado. El método de detección directa también ofrece una gran flexibilidad en el diseño de experimentos multicolor, gracias a la amplia gama de fluorocromos disponibles en el mercado hoy en día.
¿Cuándo debe utilizar el método de marcaje directo de anticuerpos?
Considere el uso de este método cuando:
- Hay un alto riesgo de que el anticuerpo secundario no se una a nada específico.
- Hay dificultad para obtener anticuerpos secundarios (por ejemplo, cuando se trabaja con anticuerpos primarios de organismos no estándar).
- Hay una necesidad de obtener resultados rápidamente.
¿Cuáles son las limitaciones del método directo?
A pesar de las aparentes ventajas que ofrece el método directo, hay ocasiones en las que no es el más adecuado para su aplicación. A continuación se explica el motivo.
- No es tan sensible y versátil en comparación con los métodos indirectos.
- La etiqueta del anticuerpo primario puede no ser adecuada para aplicaciones posteriores.
- Existe una gama limitada de anticuerpos primarios marcados directamente, por lo que es posible que tenga que crear uno en el laboratorio que se adapte a la aplicación prevista.
Métodos de etiquetado de anticuerpos indirectos
Mientras que el método de etiquetado directo es ideal para detectar antígenos altamente expresados, los métodos de etiquetado indirecto son perfectos para aplicaciones que implican antígenos que no se expresan claramente. Al utilizar anticuerpos secundarios marcados, se puede lograr una mayor sensibilidad debido a la amplificación de la señal resultante de la unión de múltiples anticuerpos auxiliares al anticuerpo primario.
¿Cuáles son las otras ventajas del método indirecto?
Además de la mayor sensibilidad, los métodos de marcaje indirecto de anticuerpos también ofrecen las siguientes ventajas:
- El mismo anticuerpo secundario puede utilizarse en diferentes aplicaciones para validar la detección del antígeno diana.
- Puede utilizar cualquier anticuerpo secundario dado con cualquier anticuerpo primario del mismo tipo y especie huésped, dependiendo de la aplicación prevista. Alternativamente, puede visualizar fácilmente su proteína diana simplemente intercambiando el anticuerpo secundario marcado que esté utilizando.
- Hay una amplia gama de reactivos secundarios marcados con enzimas y fluoróforos disponibles.
¿Existen desventajas o limitaciones en el método indirecto?
Aunque se pueden decir muchas cosas buenas sobre este método, no es adecuado para todas las aplicaciones y puede aumentar la unión no específica del anticuerpo secundario. También requiere pasos de bloqueo y controles adicionales.
Métodos comunes de etiquetado y conjugación de anticuerpos
- Método de ésteres de NHS (succinimidilo): un método relativamente sencillo utilizado para conjugar anticuerpos con colorantes fluorescentes. Sin embargo, dado que los ésteres NHS son extremadamente inestables y sensibles a la humedad, será necesario utilizar el anticuerpo marcado inmediatamente.
- Método del isotiocianato – Aunque este reactivo puede ser más estable en comparación con los ésteres NHS, las reacciones deben llevarse a cabo a un pH de 9,5 o superior. Lamentablemente, algunos anticuerpos monoclonales no pueden soportar valores de pH elevados.
- Método de la carbodiimida – utiliza reactivos de carbodiimida (por ejemplo, EDC) para crear enlaces covalentes entre moléculas que contienen grupos amina y carboxilo. Las carbodiimidas son altamente reactivas, por lo que son ideales para anticuerpos con materiales relativamente inertes.
- Método de las dos etiquetas – este método requiere que el anticuerpo sea marcado antes de la unión de una etiqueta.
- Método del periodato – comúnmente utilizado para generar conjugados HRP-anticuerpo. Las moléculas de periodato en el reactivo activan la HRP reaccionando con las cadenas de carbohidratos para crear grupos aldehídos que luego reaccionan con los residuos de lisina en las moléculas de anticuerpos.