Lorsqu’il s’agit de marquer vos anticorps pour une application en aval nécessitant une détection du signal, vous avez deux choix. Vous pouvez opter pour l’approche directe ou l’approche indirecte. Comment savoir quelle méthode utiliser ? Voici quelques éléments à connaître pour être sûr de choisir la bonne méthode pour l’application prévue.
Méthode de marquage direct des anticorps
La méthode de marquage direct est une technique simple qui peut être utilisée pour détecter des antigènes hautement exprimés. Dans cette méthode, l’anticorps principal est conjugué à un marqueur (par exemple, HRP, AP, ou fluorochrome) de sorte qu’il n’est pas nécessaire d’utiliser un anticorps secondaire. Cela signifie que, puisque l’anticorps primaire fait tout le travail, vous n’avez pas besoin d’effectuer des étapes supplémentaires d’incubation et de lavage. La méthode de détection directe offre également une grande flexibilité dans la conception d’expériences multicolores, grâce à la large gamme de fluorochromes disponibles sur le marché aujourd’hui.
Quand faut-il utiliser la méthode de marquage direct des anticorps ?
Envisagez d’utiliser cette méthode lorsque :
- Il existe un risque élevé que l’anticorps secondaire ne se lie à rien de spécifique.
- Il est difficile d’obtenir des anticorps secondaires (par ex, lorsque vous travaillez avec des anticorps primaires d’organismes non standard).
- Il est nécessaire d’obtenir des résultats rapidement.
Quelles sont les limites de la méthode directe ?
Malgré les avantages apparents que la méthode directe a à offrir, il y a des moments où elle n’est pas idéalement adaptée à votre application. Voici pourquoi.
- Elle n’est pas aussi sensible et polyvalente par rapport aux méthodes indirectes.
- Le marquage de l’anticorps primaire peut ne pas convenir pour des applications ultérieures.
- Il existe une gamme limitée d’anticorps primaires directement marqués, vous devrez donc peut-être en créer un en laboratoire qui convienne à l’application prévue.
Méthodes de marquage indirect des anticorps
Alors que la méthode de marquage direct est idéale pour détecter les antigènes hautement exprimés, les méthodes de marquage indirect sont parfaites pour les applications impliquant des antigènes qui ne sont pas clairement exprimés. En utilisant des anticorps secondaires marqués, vous pouvez obtenir une plus grande sensibilité grâce à l’amplification du signal résultant de la liaison de plusieurs anticorps auxiliaires à l’anticorps primaire.
Quels sont les autres avantages de la méthode indirecte ?
A part la sensibilité accrue, les méthodes de marquage indirect des anticorps offrent également les avantages suivants :
- Le même anticorps secondaire peut être utilisé dans différentes applications pour valider la détection de l’antigène cible.
- Vous pouvez utiliser n’importe quel anticorps secondaire donné avec n’importe quel anticorps primaire du même type et de la même espèce hôte, selon l’application prévue. Alternativement, vous pouvez facilement visualiser votre protéine cible en échangeant simplement l’anticorps secondaire marqué que vous utilisez.
- Il existe une large gamme de réactifs secondaires marqués par des enzymes et des fluorophores disponibles.
Y a-t-il des inconvénients ou des limitations à la méthode indirecte ?
Bien que beaucoup de bonnes choses puissent être dites à propos de cette méthode, elle ne convient pas à toutes les applications et peut augmenter la liaison non spécifique de l’anticorps secondaire. Elle nécessite également des étapes de blocage et des contrôles supplémentaires.
Méthodes courantes de marquage et de conjugaison des anticorps
- Méthode de l’ester NHS (succinimidyl) – une méthode relativement simple utilisée pour conjuguer les anticorps avec des colorants fluorescents. Cependant, les esters NHS étant extrêmement instables et sensibles à l’humidité, vous devrez utiliser l’anticorps marqué immédiatement.
- Méthode de l’isothiocyanate – Bien que ce réactif puisse être plus stable par rapport aux esters NHS, les réactions doivent être effectuées à un pH de 9,5 ou plus. Malheureusement, certains anticorps monoclonaux ne supportent pas des valeurs de pH élevées.
- Méthode du carbodiimide – utilise des réactifs carbodiimides (par exemple, EDC) pour créer des liaisons covalentes entre des molécules contenant des groupes amine et carboxyle. Les carbodiimides sont très réactifs, ils sont donc idéaux pour les anticorps avec des matériaux relativement inertes.
- Méthode à deux marqueurs – cette méthode nécessite que l’anticorps soit marqué avant la fixation d’un marqueur.
- Méthode au périodate – couramment utilisée pour générer des conjugués HRP-anticorps. Les molécules de périodate dans le réactif activent le HRP en réagissant avec les chaînes d’hydrates de carbone pour créer des groupes aldéhydes qui réagissent ensuite avec les résidus lysine dans les molécules d’anticorps.