Quando si tratta di etichettare i tuoi anticorpi per applicazioni a valle che richiedono la rilevazione del segnale, hai due scelte. Puoi scegliere l’approccio diretto o quello indiretto. Come fate a sapere quale metodo usare? Ecco alcune cose che devi sapere per assicurarti di scegliere il metodo giusto per l’applicazione prevista.
Metodo di etichettatura diretta degli anticorpi
Il metodo di etichettatura diretta è una tecnica semplice che può essere usata per rilevare antigeni altamente espressi. In questo metodo, l’anticorpo principale è coniugato con un’etichetta (ad esempio, HRP, AP, o fluorocromo), quindi non c’è bisogno di un anticorpo secondario. Ciò significa che, poiché l’anticorpo primario sta facendo tutto il lavoro, non è necessario eseguire ulteriori fasi di incubazione e lavaggio. Il metodo di rilevamento diretto offre anche una grande flessibilità nella progettazione di esperimenti multicolore, grazie alla vasta gamma di fluorocromi disponibili oggi sul mercato.
Quando si dovrebbe usare il metodo di etichettatura diretta degli anticorpi?
Considera l’utilizzo di questo metodo quando:
- C’è un alto rischio che l’anticorpo secondario non si leghi a qualcosa di specifico.
- C’è difficoltà ad ottenere anticorpi secondari (ad es, quando si lavora con anticorpi primari di organismi non standard).
- C’è la necessità di ottenere risultati rapidamente.
Quali sono i limiti del metodo diretto?
Nonostante gli evidenti vantaggi che il metodo diretto ha da offrire, ci sono momenti in cui non è idealmente adatto alla tua applicazione. Ecco perché.
- Non è così sensibile e versatile rispetto ai metodi indiretti.
- L’etichetta dell’anticorpo primario potrebbe non essere adatta alle applicazioni successive.
- C’è una gamma limitata di anticorpi primari marcati direttamente, quindi potrebbe essere necessario crearne uno in laboratorio che si adatti all’applicazione prevista.
Metodi di etichettatura indiretta degli anticorpi
Mentre il metodo di etichettatura diretta è ideale per rilevare antigeni altamente espressi, i metodi di etichettatura indiretta sono perfetti per applicazioni che coinvolgono antigeni che non sono espressi chiaramente. Utilizzando anticorpi secondari marcati, è possibile ottenere una maggiore sensibilità grazie all’amplificazione del segnale risultante dal legame di più anticorpi secondari all’anticorpo primario.
Quali sono gli altri vantaggi del metodo indiretto?
Oltre alla maggiore sensibilità, i metodi di etichettatura indiretta degli anticorpi offrono anche i seguenti vantaggi:
- Lo stesso anticorpo secondario può essere utilizzato in diverse applicazioni per convalidare la rilevazione dell’antigene bersaglio.
- È possibile utilizzare qualsiasi dato anticorpo secondario con qualsiasi anticorpo primario dello stesso tipo e specie ospite, a seconda dell’applicazione prevista. In alternativa, è possibile visualizzare facilmente la proteina bersaglio semplicemente scambiando l’anticorpo secondario marcato che si sta utilizzando.
- C’è una vasta gamma di reagenti secondari marcati con enzimi e fluorofori disponibili.
Ci sono svantaggi o limitazioni al metodo indiretto?
Mentre si possono dire molte cose buone su questo metodo, non è adatto a tutte le applicazioni e può aumentare il legame aspecifico dell’anticorpo secondario. Richiede anche ulteriori fasi di blocco e controlli.
Metodi comuni di etichettatura e coniugazione degli anticorpi
- Metodo degli esteri NHS (Succinimidyl) – un metodo relativamente semplice usato per coniugare gli anticorpi con coloranti fluorescenti. Tuttavia, poiché gli esteri NHS sono estremamente instabili e sensibili all’umidità, sarà necessario utilizzare l’anticorpo marcato immediatamente.
- Metodo dell’isotiocianato – mentre questo reagente può essere più stabile rispetto agli esteri NHS, le reazioni dovrebbero essere effettuate a pH 9,5 o superiore. Sfortunatamente, alcuni anticorpi monoclonali non possono sopportare alti valori di pH.
- Metodo Carbodiimide – utilizza reagenti carbodiimmidi (ad esempio, EDC) per creare legami covalenti tra molecole contenenti gruppi amminici e carbossilici. I carbodiimmidi sono altamente reattivi, quindi sono ideali per gli anticorpi con materiali relativamente inerti.
- Metodo dei due tag – questo metodo richiede che l’anticorpo sia etichettato prima dell’attacco di un’etichetta.
- Metodo del periodato – comunemente usato per generare coniugati HRP-anticorpo. Le molecole di periodato nel reagente attivano l’HRP reagendo con le catene di carboidrati per creare gruppi aldeidici che poi reagiscono con i residui di lisina nelle molecole di anticorpo.