シグナル検出を必要とする下流アプリケーションのために抗体をラベル化する場合、2つの選択肢があります。 直接アプローチと間接アプローチのどちらかを選択できます。 どちらの方法を使うべきか、どのように判断すればよいのでしょうか。
直接抗体標識法
直接抗体標識法は、高発現抗原の検出に使用できる簡単な手法です。 この方法では、主抗体に標識（HRP、AP、蛍光色素など）を結合させるため、二次抗体を必要としない。 つまり、一次抗体がすべての働きをするので、インキュベーションや洗浄のステップを追加する必要がありません。
直接検出法は、現在市販されているさまざまな蛍光色素のおかげで、マルチカラー実験をデザインする際にも非常に柔軟性があります。
以下のような場合に、この方法の使用を検討してください：
- 二次抗体が特定のものに結合しないリスクが高い場合。
- 二次抗体の入手が困難な場合 (標準以外の生物の一次抗体を使用する場合など)。
結果を迅速に得る必要がある場合。
直接法の限界は何ですか。 その理由をご説明します。
- 間接法と比較して、感度や汎用性に劣ります。
- 一次抗体のラベルは、その後のアプリケーションに適さない場合があります。
- 直接標識一次抗体の種類が限られているので、目的のアプリケーションに適したものをラボで作成しなければならない場合があります。
間接抗体標識法
直接標識法は高発現抗原の検出に最適ですが、間接標識法は明確に発現していない抗原を含むアプリケーションに最適です。 また、標識二次抗体を用いることで、一次抗体に複数の補助抗体が結合してシグナルが増幅されるため、より高い感度が得られます。
間接法の他の利点は何ですか？
感度の向上以外にも、間接的な抗体標識法には以下の利点があります。
- 異なるアプリケーション間で同じ二次抗体を使用し、標的抗原検出を検証することができます。 また、使用している標識二次抗体を交換するだけで、簡単にターゲットタンパク質を可視化することができます。
- 利用可能な酵素および蛍光標識二次試薬の種類は豊富です。
間接法にデメリットや制限はありますか？ また、追加のブロッキング工程とコントロールが必要です。
一般的な抗体の標識およびコンジュゲーション法
- NHS (スクシンイミジル) エステル法 – 抗体を蛍光色素と結合させるための比較的簡単な方法です。
- イソチオシアネート法 – NHSエステルに比べて安定ですが、pH9.5以上で反応させることが必要です。
- カルボジイミド法-カルボジイミド試薬（例：EDC）を用いて、アミンとカルボキシル基を含む分子間に共有結合を形成する方法。
- Two-tag Method – この方法では、標識の付着の前に抗体がタグ付けされる必要があります。
- Periodate Method – HRP-抗体コンジュゲートの生成によく使用される方法です。 試薬中の過ヨウ素酸分子は、炭水化物鎖と反応してアルデヒド基を生成し、抗体分子中のリジン残基と反応してHRPを活性化します
。